Dissertação
{pt=Purification of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cells for Regenerative Medicine Applications} {} EVALUATED
{pt=Células humanas pluripotentes induzidas (hiPSCs) são uma promissora fonte de células para aplicações clínicas, tais como transplantes de órgãos e tecidos construídos in vitro, devido à sua capacidade para se renovarem e para serem diferenciadas em células das três camadas germinais embrionárias. Aqui apresentam-se os resultados depois de diferenciar hiPSCs em progenitores neurais (NPs), com 80 % de eficiência, por meio do protocolo de diferenciação que inibe a via de sinalização SMAD, confirmando a robusteza deste método que usa duas moléculas de baixo peso molecular (SB431542, LDN193189) para gerar entidades neurais Pax6 e Nestin-positivas. Um dos maiores problemas, relacionados com a geração in vitro de populações derivadas de PSCs, é o potencial tumorogénico das células que não são capazes de se diferenciar. Estas PSCs, que permanecem nas culturas, têm o potencial para gerar teratomas, depois de transplantadas, e podem interferir com o resultado do protocolo de diferenciação in vitro. Uma estratégia para superar este problema consiste em eliminar as células pluripotentes, que “contaminam” as culturas, durante o processo de diferenciação. Neste contexto, a primeira estratégia de separação celular testada foi a cromatografia por afinidade com colunas de criogéis monolíticos. Contudo, esta abordagem foi muito desafiante porque as colunas cromatográficas avaliadas não apresentavam um tamanho e uma interconectividade dos poros adequados. Numa segunda abordagem, as células Tra-1-60 positivas foram descartadas por separação celular activada por magnetismo (MACS), que apresentou uma eficiência de purificação de aproximadamente 80 %, deixando as populações purificadas com apenas 1 a 5 % de células Tra-1-60 positivas., en=Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) are a promising source of cells for clinical applications, such as transplantation of clinical engineered tissues and organs, due to their ability to self-renew and to be differentiated into cells from the three embryonic germ layers. In this thesis, the differentiation of hiPSCs into neural progenitors (NPs) was established, with a 80 % efficiency, by means of the dual-SMAD inhibition protocol which confirmed the robustness of this method that is based on the use of two small molecules (SB431542 and LDN193189) to generate Pax6 and Nestin- positive neural entities. One of the major hurdles related to the in vitro generation of PSC-derived populations is the tumorigenic potential of cells that are unable to differentiate. These remaining PSCs have the potential to generate teratomas after being transplanted, and may interfere with the outcome of the in vitro differentiation protocol. One strategy to tackle this problem is to make the depletion of the “contaminating” cells during the differentiation process. In this context, two different affinity-based separation methods were evaluated in this thesis. The first cell separation method tested used affinity chromatography cryogel monolithic columns. However, this approach was very challenging since the chromatographic columns evaluated did not present an adequate pore size and interconnectivity. In a second approach, the depletion of Tra-1-60 positive PSCs was tested with magnetic activated cell sorting (MACS), which presented an efficiency of purification of approximately 80 %, leaving the purified populations with only 1 - 6 % of Tra-1-60 positive cells. }
outubro 30, 2012, 14:30
Orientação
CO-ORIENTADOR
Maria Margarida Fonseca Rodrigues Diogo
Departamento de Bioengenharia (DBE)
Equip.Prof.Auxiliar Convidado
