Dissertação
{pt=Monitorização em tempo real do processo de diferenciação neural in vitro a partir de células estaminais embrionárias} {} EVALUATED
{pt=Apesar do conhecimento de mecanismos moleculares envolvidos na especificação dos tipos celulares do tubo neural durante a embriogénese, a dinâmica celular da diferenciação na linhagem neural e propagação estável deste tipo de células in vitro é ainda um aspecto de forte investigação. A estratégia promissora de terapia celular no sistema nervoso para tratamento de doenças degenerativas como a doença de Parkinson é um dos objectivos finais do investimento neste campo. O protocolo de diferenciação de precursores neurais em monocamada proposto por Ying et al., 2003, partindo de células estaminais embrionárias da linhagem 46C foi usado neste estudo, tendo sido definido como objectivo a monitorização em tempo real da dinâmica dos precursores neurais em roseta, e confirmação da presença de movimento intercinético nuclear característico de células neuroepiteliais, com consequente relação com os estadios do ciclo celular das células envolvidas. Abordagens iniciais de microscopia de fluorescência de campo claro e confocal não se mostraram eficazes na obtenção de imagens para análise por comprometerem a viabilidade e morfologia precursores. Monitorização de microscopia em campo claro com luz visível revelou-se menos lesiva para as culturas em questão, tendo sidas obtidas imagens de 16h do processo de diferenciação neural mostrando que os precursores neurais apresentam movimentos intercinéticos nucleares, decorrendo as mitoses na região apical da roseta. Estratégias de microscopia apresentam-se assim promissoras na monitorização da dinâmica celular deste tipo de células, podendo no futuro ser optimizadas condições para observação de variados comportamentos celulares ou mesmo até ao nível molecular com recurso a marcadores fluorescentes. , en=Despite the broad insight into the molecular mechanisms that specify neuronal cell type in the neural tube during embryogenesis, cell behaviour underlying neuron production and stable propagation in culture of neuronal progenitors is still largely unknown. Cell therapy in the nervous system is a promising strategy to cure diseases like Parkinson?s or for nerve regeneration in spinal cord lesions. The protocol for conversion of 46C embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture, proposed by Ying et al., 2003, has been used in this study. Our main goals were to follow the process of in vitro neuronal differentiation, establishing whether Sox1-GFP positive neural progenitors reveal the classical interkinetic nuclear movement (INM) of embryonic neuroepithelial cells, and also to correlate this movement with the cell cycle stages of neural progenitors. Using brightfield and confocal microscopes we have tested screening approaches based on fluorescence. However, these techniques compromise progenitor morphology in rosettes and cellular viability. Alternatively, we have optimized visible light microscopy conditions that enable maintenance of cell viability during long period observations. Films with 16h of duration show that neural precursors exhibit INM, with mitosis images located in the rosette apical region. Moreover, our results indicate that the somal position of cells varies with the cell cycle progression. Strategies of microscopy might prove to be extremely useful in monitoring the cellular dynamics in these in vitro conditions, with the possibility of optimizing conditions for the observation of several cellular behaviours at the molecular level, by the use of fluorescent reporters.}
novembro 9, 2007, 17:30
Publicação
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Orientação
ORIENTADOR
Domingos Manuel Pinto Henrique
Departamento de Engenharia Química e Biológica (DEQB)
Professor Associado Convidado