Dissertação

Influence of NADH-dehydrogenases on polyhydroxyalkanoate production in Pseudomonas taiwanensis VLB120 EVALUATED

Polihidroxialcanoatos (PHAs) são biopolímeros que se acumulam no citoplasma de bactérias quando há stresse ambiental, ou uma elevada concentração de NADH, e excesso de carbono. O objetivo deste projeto consistiu em estudar a influência de NADH-desidrogenases (NDHs) na produção de PHAs em Pseudomonas taiwanensis VLB120. A estirpe usada possui três NDHs: uma NADH-desidrogenase tipo I (NDH-I), codificada pelo operão nuo, e duas NADH-desidrogenases tipo II (NDH-II), codificadas pelos genes PVLB_13270 e PVLB_21880. Para estudar a influência das NDHs na produção de PHAs foram testadas estirpes de P. taiwanensis VLB120 com mutações nessas NDHs. Inicialmente, caracterizou-se o crescimento das estirpes para verificar se as mutações nas NDHs afetavam as células. Apenas P. taiwanensis VLB120ΔΔndh teve o metabolismo afetado. Dado os mutantes terem sido cultivados na ausência de stress, as células poderiam consumir os PHAs caso esses fossem produzidos. Assim, eliminou-se o gene que codifica a PHA depolimerase (phaZ) em todos os mutantes para garantir a não degradação de PHAs. Resultados obtidos por microscopia de fluorescência, confirmaram a presença de grânulos de PHAs nos mutantes. A quantificação relativa da produção de PHAs foi efectuada por dois métodos - um método rápido envolvendo Vermelho de Nilo e outro que consiste em cromatografia gasosa associada a espectrometria de massa (GC-MS). O método rápido provou ser inadequado. A quantificação por GC-MS mostrou que os mutantes VLB120Δ13270ΔphaZ, VLB120Δ21880ΔphaZ, VLB120ΔnuoΔphaZ, VLB120ΔΔndhΔphaZ e VLB120ΔnuoΔ13270ΔphaZ produziram respetivamente, 60%, 109%, 181%, 264% e 379% mais que a estirpe selvagem, confirmando o envolvimento das NDHs no aumento da biossíntese de PHAs.
P. taiwanensis VLB120, NADH-desidrogenases, Polihydroxialcanoatos, Vermelho de Nilo, GC-MS

Dezembro 4, 2017, 9:0

Publicação

Obra sujeita a Direitos de Autor

Orientação

ORIENTADOR

Leonilde de Fátima Morais Moreira

Departamento de Bioengenharia (DBE)

Professor Auxiliar

ORIENTADOR

Lars Mathias Blank

Institute of Applied Microbiology – iAMB, RWTH Aachen University

Professor