Dissertação
Optimisation of Culture Conditions in P450 Monooxygenase Expression EVALUATED
A P450 BM3 (CYP102A1) é uma mono-oxigenase que contém um grupo heme. Esta enzima foi isolada da Bacillus megaterium, uma bactéria que pode ser encontrada no solo. CYP102A1 é um biocatalisador interessante devido à conversão de vários substratos, à sua elevada actividade e aos produtos de reacção obtidos em condições pouco exigentes. A P450 BM3 apresenta uma elevada actividade catalítica na hidroxilação de ácidos gordos de cadeia média a longa, em posições sub-terminais. Diferentes estudos mostram que a sua actividade pode ser aumentada e a sua selectividade melhorada através da mutagénese do centro activo ou dos canais de transporte do substrato. O objectivo deste trabalho foi avaliar a influência de parâmetros de cultivo para a produção da P450 BM3 e das suas variantes em cultivações em E. coli, permitindo a sua optimização e futuro up-scaling. Os resultados obtidos indicam que um meio de auto-indução com uma razão de 1,29 g de carbono (lactose)/L de lactose para 1,00 g de carbono (glicerol)/L é o mais favorável para a produção de P450 BM3. Concentrações mais elevadas deste citocromo são obtidas para cultivos em condições não limitadas pelo oxigénio, com um pH de 6.8 e a 30 °C. Uma concentração de pelo menos 10,0 mg/L de FeCl3·6 H2O no meio de cultura e o uso de ácido aminolevulínico são benéficos na produção desta mono-oxigenase. Ao optimizar os parâmetros acima mencionados, a produção das variantes de P450 BM3 é aumentada 1,6 a 3,9 vezes em comparação com as condições standard usadas antes deste trabalho.
dezembro 6, 2016, 15:30
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