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Dissertação

Using CRISPR-Cas technology to generate inducible KO mouse ES cell lines for Ago1 and Ago3 EVALUATED

Detalhes: A função das proteínas Argonautas é bem conhecida no citoplasma, no entanto, estudos recentes mostram que estas também podem ser encontradas no núcleo, onde a sua função não é ainda conhecida. Para perceber esta função, foram criadas duas linhas celulares de células estaminais embrionárias de murganho com Argonautas modificadas, incorporando uma sequência para um epítopo e para um AID que vai induzir a degradação completa destas proteínas de forma imediata, recorrendo ao sistema de degradação induzida por auxina adaptado das plantas. Para tal, recorreu-se a ferramentas de edição do genoma, nomeadamente o sistema CRISPR/Cas9. Duas construções, para a Ago1 e para a Ago3, foram desenhadas de modo a inserir a sequência do epítopo V5 e do AID antes do primeiro exão do gene. Após criação da linha celular OsTIR, que permite reconhecimento do AID em células eucariotas, as duas construções foram transfectadas nesta linha celular em conjunto com a Cas9 e RNA guia. Foram criadas duas linhas celulares, A1V5AID e A3V5AID, genotipadas por PCR para selecionar clones homozigóticos, de modo a degradar completamente as proteínas modificadas. Dos 68 clones obtidos para a linha celular A1V5AID, apenas dois eram homozigóticos e dois heterozigóticos. Para a linha celular A3V5AID, a primeira transfecção produziu 39 clones, nenhum com inserção. Na segunda transfecção, em 59 clones apenas um era heterozigótico e não expressava Ago3. Não foram assim obtidos clones para esta linha celular. Caracterização futura dos clones A1V5AID ajudará a obter uma nova visão das funções da proteína Ago1 no núcleo de células estaminais.
Keywords: Argonautas, CRISPR/Cas9, AID, Células Estaminais Embrionárias Murganho, Ago1, Ago3

Discussão: novembro 30, 2016, 16:0