Dissertação

Targeting bottlenecks in the secretory pathway of yeast EVALUATED

As leveduras são organismos complexos de fácil manipulação genética, sendo capazes de não só secretar, mas também atribuir conformação tridimensional a proteínas humanas, o que lhes confere a complexidade de sistemas eucarióticos. As vantagens de expressar genes em Saccharomyces cerevisiae prendem-se com o seu rápido crescimento celular, a sua segurança microbiológica e o seu sucesso em indústrias como a de produção de insulina humana. Estas células possuem um sistema complexo de folding e uma capacidade de excretar as proteínas funcionais e puras. No entanto, as leveduras apresentam diversos bottlenecks na via secretória, limitantes do rendimento de produção proteica heteróloga. Portanto, o objetivo principal prende-se com o desenvolvimento e aprimoramento de uma técnica para o estudo de modificações que afetam a expressão de anticorpos humanos em levedura. O método utilizado possibilita a comparação de diferentes genes, permitindo o refinamento da estirpe repórter e o melhoramento da técnica de screening utilizada. Esta técnica seguiu o desaparecimento do anticorpo modelo das células, ajudando à diferenciação da sua localização entre o complexo de Golgi e o retículo endoplasmático, que constitui um bottleneck da secreção proteica em leveduras. As estirpes foram comparadas com base em resultados de Western blot e ELISA, para diferentes tempos e temperaturas de indução. Conclui-se que a temperatura após a indução da produção não tem um efeito significativo desde que se mantenha próxima da temperatura de crescimento celular. Tento em conta as concentrações de anticorpo, a estirpe SS328 teve um melhor desempenho perante diversas mutações no seu mecanismo de tráfico celular.
Produção proteica heteróloga, Folding proteico, Anticorpo; bottleneck, Retículo endoplasmático

Novembro 15, 2016, 16:0

Publicação

Obra sujeita a Direitos de Autor

Orientação

ORIENTADOR

Isabel Maria De Sá Correia Leite de Almeida

Departamento de Bioengenharia (DBE)

Professor Catedrático

ORIENTADOR

Alexander Frey

Aalto University

Professor