Dissertação

Development of a method for the purification of minicircles EVALUATED

A terapia genética e vacinação com DNA são áreas nas quais se tem observado um elevado interesse, sendo registado um elevado e contínuo número de ensaios clínicos. O uso de plasmídeos como vectores não virais de entrega de genes tem sido amplamente aplicado resultando, no entanto, em baixas eficiências de transfecção e expressão génica. A procura por vectores mais seguros e eficientes resultou no desenvolvimento de um processo de recombinação in vivo em E. coli, no qual um vector de sequência eucariótica é obtido por excisão a partir de um plasmídeo replicativo contendo sequências procarióticas – o sistema de produção de minicírculos de DNA. Durante o crescimento bacteriano, moléculas de interesse terapêutico – minicírculos – são formadas em conjunto com miniplasmídeos que contêm toda a informação procariótica. Um dos obstáculos ao desenvolvimento de processos eficientes para purificação de minicírculos reside na elevada semelhança físico-química entre minicírculos e miniplasmídeos. O principal objectivo deste trabalho foi o desenvolvimento de um método eficiente, simples, reprodutível e com possível aumento de escala para a purificação de minicírculos. Com esta intenção, foi explorada uma diferença em hidrofobicidade não existente naturalmente entre estas moléculas, recorrendo a uma enzima capaz de cortar uma das cadeias do miniplasmídeo, relaxando-o. A separação do minicírculo com interesse terapêutico de moléculas de miniplasmídeo e RNA foi efectuada com sucesso num único passo de cromatografia de interacção hidrofóbica, sendo verificadas a robustez e reprodutibilidade do método. Monitorização do processo e controlo de qualidade do produto deverão ser objecto de trabalhos futuros.
terapia genética, minicírculos, restrição enzimática, DNA-nicking enzima, cromatografia de interacção hidrofóbica

Dezembro 12, 2014, 10:30

Publicação

Obra sujeita a Direitos de Autor

Orientação

CO-ORIENTADOR

Gabriel António Amaro Monteiro

Departamento de Bioengenharia (DBE)

Professor Auxiliar

ORIENTADOR

Duarte Miguel De França Teixeira dos Prazeres

Departamento de Bioengenharia (DBE)

Professor Associado