Dissertação

Using CRISPR/Cas9 technology to probe centrosomal protein function EVALUATED

Os sistemas CRISPR (do inglês clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas do tipo II emergiram recentemente como ferramentas eficazes para editar e manipular genes. As nucleases (Cas9) que constituem estes sistemas, são guiadas por elementos de RNA (sgRNA) e foram re-inventadas para induzir danos em loci específicos do DNA. As mutações surgem assim que a maquinaria celular repara os danos por recombinação não-homóloga (NHEJ) ou recombinação homóloga, assistida (HDR). Neste último caso, poderão ser introduzidos oligonucleótidos, desenhados de forma a direcionar a reparação por homologia e, assim, induzir modificações específicas. TACC3 é uma proteína encontrada nos centrossomas, envolvida quer em promover a síntese de microtúbulos quer em estabilizar o fuso mitótico. Estudos recentes mostraram que uma mutação pontual (F543A) na TACC3 de Gallus gallus acelera a mitose. Com o objetivo de averiguar se este fenótipo se mantinha noutras linhas celulares pretendeu-se, nesta tese, gerar mutantes em células NIH/3T3, contendo uma mutação equivalente, usando a tecnologia CRISPR/Cas9. De forma a optimizar este método para editar o gene Tacc3, três sgRNAs foram desenhados e dois métodos de transfecção foram testados. A mutação desejada foi introduzida usando um oligonucleótido de 199-nt. Apesar de não se ter detetado nenhum evento de reparação por homologia, os sgRNAs mostraram ser eficazes em localizar o gene em questão uma vez que alguns mutantes continham deleções neste locus. Por imunofluorescência verificou-se que a localização da TACC3 tinha sido afetada pelo que as modificações induzidas deverão ter alterado domínios importantes no recrutamento desta proteína para os centrossomas.
CRISPR/Cas9, NIH/3T3, oligonucleótido, TACC3, mitose acelerada

Novembro 5, 2014, 10:0

Publicação

Obra sujeita a Direitos de Autor

Orientação

CO-ORIENTADOR

Fanni Gergely

University of Cambridge

Doutor

ORIENTADOR

Arsénio do Carmo Sales Mendes Fialho

Departamento de Bioengenharia (DBE)

Professor Associado