Dissertação

Production of recombinant human aldehyde oxidase in E. coli and optimization of its application for preparative synthesis of oxidized drug metabolites EVALUATED

Um gene recombinante de aldeído oxidase (AO) humana, uma enzima oxidativa de drogas crescentemente relevante da Fase I, foi expressa numa estirpe de Escherichia coli. Com o objectivo de optimizar a síntese preparativa de metabolitos de drogas oxidados pela AO para estudos farmacocinéticos e farmacodinâmicos futuros, diferentes métodos de ruptura celular e condições de cultura celular em frascos agitados e bioreactores e de biotransformação à escala analítica foram testados. A produtividade volumétrica em unidades enzimáticas por volume de cultura foi aumentada 24 vezes por sucessiva optimização das condições de cultura celular. A maior produtividade foi alcançada num bioreactor agitado de 25 l sem limitação por oxigénio e com elevado caudal de alimentação de lactose, usando meio de cultura sintético suplementado com concentrações relativamente elevadas de fontes nutricionais complexas. Suspensões de células inteiras (não sujeitas a ruptura) altamente concentradas e bem arejadas sem quaisquer aditivos, a pH neutro e temperaturas relativamente baixas, representaram o biocatalisador que levou à conversão optimizada do substrato de referência fenantridina. A escolha do solvente para o substrato e do agente tampão para a biotransformação mostrou ter uma influência importante na conversão. Após testar-se 12 possíveis substratos da AO, famciclovir foi escolhido e estudado como substrato da AO para biotransformação à escala preparativa sob condições optimizadas e foi convertido com sucesso em metabolitos oxidados. Apesar de ser possível que o sistema de expressão actual possa ser melhorado no futuro, o protocolo optimizado representa um método viável para a síntese preparativa de metabolitos de drogas oxidados pela AO.
aldeído oxidase, metabolismo oxidativo de drogas, síntese preparativa, Escherichia coli, optimização

Setembro 28, 2012, 14:0

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Orientação

CO-ORIENTADOR

Matthias Kittelmann

Novartis Pharma. Inst. of BioMedical Research

Doutor

ORIENTADOR

Ana Margarida Nunes da Mata Pires de Azevedo

Departamento de Bioengenharia (DBE)

Doutora