Dissertação
Optimization of cultivation conditions to achieve high titers of recombinant trypsinogen with Pichia pastoris expression system cultured on different substrates and their mixtures EVALUATED
A levedura Pichia pastoris tornou-se num popular sistema de expressão de proteínas recombinantes devido ao seu forte promotor AOX1. Tipicamente, usa-se glicerol para obter altas concentrações de biomassa, e metanol para induzir a expressão da proteína recombinante, assim como, para sustentar o crescimento celular. Limitações associadas com o metabolismo do metanol incentivaram a pesquisa de novas estratégias, usando misturas de substratos onde parte do metanol é substituída por outra fonte de carbono. Misturas de glicose, glicerol ou sorbitol com metanol foram testadas como alternativas de fontes de carbono, para a produção de tripsinogénio recombinante, clonado sob controlo do promotor AOX1 de P. pastoris. Contrariamente ao sucedido em condições de excesso de substrato, onde ocorreu crescimento diáuxico, em condições de limitação de substrato ? substrato repressivo é alimentado exponencialmente, mantendo a taxa de crescimento próxima do máximo, seguindo-se alimentação exponencial de metanol sozinho ou em mistura com outro substrato, a baixa taxa de crescimento, para expressar a proteína recombinante ? os substratos foram consumidos simultaneamente. Quando presente em excesso, a glicose agiu como forte repressor do promotor AOX1 e o sorbitol provou ser um substrato não repressivo. Demonstrou-se que o glicerol não exerce efeito repressivo no promotor AOX1, abaixo de uma determinada concentração, sendo este substrato menos repressivo que a glicose. A estratégia implementada demonstrou ser bem sucedida, e o protocolo no qual se usou uma mistura de glicose+metanol provou ser o mais adequado para suportar o crescimento da biomassa e para obter a maior concentração de tripsinogénio.
novembro 9, 2011, 9:0
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Orientação
ORIENTADOR
Isabel Maria De Sá Correia Leite de Almeida
Departamento de Bioengenharia (DBE)
Professor Catedratico