Dissertação

Towards the automated high-throughput characterization of immobilized enzymes EVALUATED

Este projecto pretendia estabelecer uma técnica automatizada de alto débito que permita caracterizar de forma célere e exaustiva o efeito na actividade de enzimas imobilizados em partículas magnéticas através da cauda de histidinas quando sujeitas a diversas condições reaccionais. O enzima utilizado foi uma transcetolase (TK) (pQR412) e o suporte de imobilização escolhido foram partículas magnéticas de agarose derivadas com grupos Ni-NTA. Inicialmente o biocatalisador escolhido foi caracterizado no que toca ao efeito do tempo de incubação dos cofactores e da escolha de dois tampões diferentes. A sua estabilidade à temperatura ambiente foi também testada com resultados positivos. Os resultados da produção do biocatalisador são apresentados e discutidos. Posteriormente a técnica de imobilização adoptada foi testada e caracterizada relativamente à quantidade de TK imobilizado nas partículas magnéticas após incubação, bem como a distribuição do biocatalisador pelos vários passos da técnica. Seguidamente, a técnica de imobilização foi utilizada manualmente com o objectivo de encontrar o tampão mais adequado e a quantidade óptima de biocatalisador, bem como os efeitos destas variáveis. O melhor tampão testado foi de Tris-HCl e a razão solução biocatalisador/partículas 1:5 (v/v) foi considerada suficiente. Por fim, a técnica de imobilização foi implementada e optimizada numa plataforma robótica automatizada. Depois de conseguir actividade em ensaios automatizados, efectuaram-se comparações entre a actividade de TK imobilizada automaticamente e manualmente. Uma diferença considerável entre os dois conjuntos de resultados foi verificada e extensamente discutida. A hipótese mais coerente levantada foi a existência de efeitos competitivos/inibitórios por parte do Imidazole presente.
Automação, enzimas imobilizados, transcetolase, alto débito, cauda de histidinas

Novembro 20, 2008, 10:30

Publicação

Obra sujeita a Direitos de Autor

Orientação

CO-ORIENTADOR

Frank Baganz

University College London

Especialista

ORIENTADOR

Luís Joaquim Pina da Fonseca

Departamento de Engenharia Química e Biológica (DEQB)

Professor Auxiliar