Dissertação
Molecular Engineering of Peptide Fusions with Removable Tags for Industrial Scale Protein Purification – Feasibility Study EVALUATED
A tecnologia enzimática tem fornecido contribuições significativas à indústria alimentar. O downstream processing de enzimas tem sido uma das áreas alvo mais importantes de investigação e desenvolvimento. A cromatografia de afinidade é o tipo de cromatografia mais específico, que permite a obtenção de elevados graus de pureza num único passo de purificação. A proteína alvo é purificada com uma tag de afinidade que é posteriormente removida com recurso a proteases. No entanto, este passo proteolítico adicional costuma levantar algumas dificuldades, tornando o processo mais complexo e dispendioso. O presente projeto assenta num teste de exequibilidade ao nível de uma cromatografia de afinidade usando inteínas como self-removable tags. Duas proteínas alvo, duas inteínas (Mxe GyrA e Mtu RecA) e duas tags de afinidade (chitin-binding domain (CBD) e polyhistidine tag) foram inicialmente testadas em seis diferentes proteínas de fusão. A purificação mais promissora foi realizada com uma fusão a expressar a inteína Mtu RecA e a tag de afinidade CBD: usando aproximadamente 5% da capacidade da coluna cromatográfica, foi possível purificar a proteína alvo com uma pureza superior a 95% e com um rendimento de purificação de 96%. No entanto, quando reproduzindo a mesma purificação usando cerca de 70% da capacidade da coluna, o rendimento foi reduzido para 3%, indicando uma falha na clivagem da inteína. Este teste de exequibilidade permitiu concluir que este sistema de purificação mediado por inteínas poderá adicionar valor à DSM Food Specialties. No entanto, serão necessárias otimizações adicionais ao nível da cromatografia e da clivagem da inteína.
novembro 7, 2019, 17:0
Publicação
Obra sujeita a Direitos de Autor
Orientação
ORIENTADOR
Guilherme Nuno De Passos Correia Matos Ferreira
Departamento de Bioengenharia (DBE)
Professor Associado Convidado
