Dissertação
Construction and characterization of the L460A L434R mutant version of glucosamine-6-phosphate synthase from Candida albicans EVALUATED
Infeções fúngicas são um problema médico atual em expansão, contudo apenas alguns antifúngicos são usados clinicamente. Glucosamina-6-fosfato (GlcN-6-P) sintase (EC 2.6.1.16), responsável por catalisar o primeiro passo da via da biossíntese de hexosamina, tem como produto final uridina 5'-difosfato-N-acetil-D-glicosamina (UDP-GlcNAc) que controla a enzima por inibição por "feedback", sendo essencial para a biossíntese de precursores da parede celular. GlcN-6-P sintase tem sido proposta como um alvo promissor para quimioterapia antifúngica e terapia antidiabética tipo 2, dado que também tem sido relacionada com fenómenos de resistência à insulina. Na estrutura cristalina parcial da enzima de C. albicans obtida por raios-X, elementos com elevada mobilidade não são visíveis, tais como a C-tail, contrastando com o obtido para Escherichia coli. Comparando a enzima eucariota com a procariota, existe uma falha no “bloqueio” do C-terminal, condicionando o grau de mobilidade ou suscetibilidade a mudanças de mobilidade aquando ligação do inibidor, causando a perda de atividade da enzima. Para verificar esta evidencia foi construída e caracterizada a versão mutante L460A L434R da enzima de C. albicans, gerada com sucesso no plasmídeo pET23b-K568HS569H-CaGFA1, transformado em E. coli Top10F’. Superexpressão da enzima mutada foi realizada em E. coli Rosetta(DE3)pLysS com posterior purificação por cromatografia de afinidade com metal imobilizado, colecionando em média 1,232 mg de proteína, medidas pelo método de Bradford. A atividade total e específica alcançada foi 0,088 ± 0,038 U e 8,351 ± 2,090 U/mg, respetivamente, medida pelo método de Morgan-Elson, e a enzima construída demonstrou ser insensível à inibição por UDP-GlcNAc.
maio 30, 2018, 15:30
Publicação
Obra sujeita a Direitos de Autor
Orientação
ORIENTADOR
Miguel Nobre Parreira Cacho Teixeira
Departamento de Bioengenharia (DBE)
Professor Auxiliar
