TP4- Hibridação de Southern (2ª parte)

19 novembro 2012, 08:00 • Leonilde Morais Moreira

Dia anterior à aula: Marcação com digoxigenina do fragmento de DNA usado como sonda, pré-hibridação e hibridação.

No dia da aula: 1. Lavagens restringentes; 2. Detecção imunoenzimática dos sinais de hibridação; 3. Discussão dos resultados esperados.

Métodos de sequenciação de DNA

15 novembro 2012, 14:30 • Leonilde Morais Moreira

Discutiram-se brevemente as estratégias para a sequenciação de genomas. Apresentou-se a técnica de pirosequenciação e as suas vantagens. Apresentou-se a técnica de sequenciação baseada na tecnologia Illumina/Solexa.

Métodos de sequenciação de DNA

13 novembro 2012, 15:00 • Leonilde Morais Moreira

Apresentou-se detalhadamente o método de sequenciação dos di-desoxi ou de Sanger-Coulson. Comparou-se com o método de degradação química de Maxam-Gilbert. Discutiram-se os aspectos característicos da sequenciação automática e sua eficiência.

A3. Hibridação de Southern (1ª parte)

13 novembro 2012, 08:00 • Cristina Anjinho Viegas

1a. Separação electroforética em gel de agarose dos fragmentos de restrição do DNA genómico de Sphingomonas elodea ATCC 31461 (digestões realizadas na aula anterior);

1b. Separação electroforética em gel de agarose da mistura de PCR preaparada na aula anterior (para amplificação de fragmento de 839 pb contendo a maior parte do gene pgmG de S. elodea); recuperação e purificação do produto de PCR, com base no sistema comercial "JetQuick gene extraction spin kit" (para posteriormente ser marcado com digoxigenina e usar como sonda de DNA na experiência de hibridação a realizar na 2ª parte do trabalho (A4)).

2. Depurinação, desnaturação e neutralização dos fragmento de DNA separados em 1a.;

3. Transferência (por capilaridade) dos fragmentos de DNA (desnaturados) do gel de agarose para uma membrana de Nylon com carga eléctrica positiva (durante a noite);

4. Fixação do DNA à membrana de Nylon por irradiação com radiação ultravioleta (260 nm);

A docente discutiu com cada grupo de alunos aspectos incorrectos e menos claros no relatório do TP1 (A1).

A3. Hibridação de Southern

12 novembro 2012, 15:30 • Cristina Anjinho Viegas

1a. Separação electroforética em gel de agarose dos fragmentos de restrição do DNA genómico de Sphingomonas elodea ATCC 31461 (digestões realizadas na aula anterior);

1b. Separação electroforética em gel de agarose da mistura de PCR preaparada na aula anterior (para amplificação de fragmento de 839 pb contendo a maior parte do gene pgmG de S. elodea); recuperação e purificação do produto de PCR, com base no sistema comercial "JetQuick gene extraction spin kit" (para posteriormente ser marcado com digoxigenina e usar como sonda de DNA na experiência de hibridação a realizar na 2ª parte do trabalho (A4)).

2. Depurinação, desnaturação e neutralização dos fragmento de DNA separados em 1a.;

3. Transferência (por capilaridade) dos fragmentos de DNA (desnaturados) do gel de agarose para uma membrana de Nylon com carga eléctrica positiva (durante a noite);

4. Fixação do DNA à membrana de Nylon por irradiação com radiação ultravioleta (260 nm);

A docente discutiu com cada grupo de alunos aspectos incorrectos e menos claros no relatório do TP1 (A1).