Dissertação

Optimizing virus discovery cDNA-AFLP (VIDISCA) EVALUATED

Virus discovery cDNA-AFLP (VIDISCA) é um método altamente reproduzível que permite a detecção de vírus de ARN/ADN sem o conhecimento prévio da sua sequência. A amplificação de sequências virais é baseada na presença de locais de enzimas de restrição. Assim, em semelhança a outras técnicas de amplificação aleatória, a detecção de vírus com VIDISCA encontra-se restringida a amostras sem interferência celular e com elevada concentração de vírus. O objectivo deste projecto foi aumentar a sensibilidade do método VIDISCA através da eliminação de duas fontes principais que competem na amplificação de PCR: ADN cromossómico e ARN ribossómico (rARN). De modo a eliminar o ADN celular residual, investigou-se por PCR em tempo-real o efeito de diferentes velocidades de centrifugação e comparou-se a acção de duas DNases. Por outro lado, através do uso de primers que anilam especificamente a sequências virais e não a rARN na reacção de retrotranscrição, obteve-se um aumento de 100 vezes na sensibilidade do método VIDISCA. Por fim, foi testado um novo sistema para purificar vírus em sistemas contendo células. Após ajuste de parâmetros, através do uso de imunoglobulinas intravenosas (IVIG) acopladas ao complexo proteína A-sefarose, obteve-se uma separação física tal que a detecção de vírus foi possível com uma sensibilidade comparável à de sistemas livres de células.
Optimização VIDISCA, centrifugação, DNase, reacção retrotranscrição, proteína A-IVIG.

Fevereiro 6, 2009, 14:0

Documentos da dissertação ainda não disponíveis publicamente

Orientação

CO-ORIENTADOR

Domingos Henriques

Instituto de Medicina Molecular , F. Medicina Lx, Unidade de Biologia do Desenvolvimento

Professor Auxiliar

ORIENTADOR

Gabriel António Amaro Monteiro

Departamento de Engenharia Química e Biológica (DEQB)

Professor Auxiliar