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Dissertação

{en_GB=Reconstitution of Drosophila fertilization for time-lapse imaging} {} EVALUATED

Detalhes: {pt=A fertilização em insetos inicia-se com a entrada de um espermatozóide pelo lado anterior do ovo. Após ativação do espermatozóide e a formação do pronúcleo paterno, pensa-se que o movimento coordenado de ambos os pronúcleos paterno e materno no citoplasma conduza à aposição pronuclear e à primeira divisão mitótica. Contudo, a sequência de eventos e a causalidade têm vindo a ser deduzidos de amostras fixas e imunocoloradas. Por isto, carecemos de relevante informação temporal e dinâmica. Como a fertilização ocorre dentro do ovo, que por sua vez é mantido dentro de um organismo vivo e preenchido com gema difrativa, qualquer conhecimento sobre microscopia temporal tem sido desafiante. O principal objetivo deste projeto foi o desenvolvimento de um ensaio para a reconstrução da fertilização em Drosophila melanogaster permitindo microscopia óptica. Tal implica o design de uma estratégia experimental na qual um pronúcleo feminino contido numa única gota de citoplasma é fertilizado com um único espermatozoide e na qual ambos os pronúcleos e o citoesqueleto associado possam ser observados com alta resolução. Ovos não fertilizados num estado de meiose foram recolhidos e observou-se a finalização da meiose. Este conhecimento é a chave para o isolamento citoplasmático do pronúcleo feminino. Por fim, foi possível realizar microscopia espaço-temporal da aposição pronuclear e da mitose em extratos de ovos recentemente fertilizados. Este novo ensaio abre novas portas ao estudo da dinâmica cromosomal durante a fertilização permitindo um conhecimento mais detalhado relacionado com a transmissão de bactérias e a incompatibilidade citoplásmica. , en=Insect fertilization starts with sperm entry at the anterior side of the egg through a protrusion called micropyle. Following sperm activation and the formation of the paternal pronucleus, it is thought that a coordinated displacement of both paternal and maternal pronuclei within the cytoplasm leads to pronuclear apposition and the first mitotic division. However, the sequence of events and the causality have been deduced from fixed and immunostained samples. Thus, we lack relevant temporal and dynamics information. Because fertilization happens deep inside the egg, which is carried inside a living organism and filled with diffractive yolk, any state-of-art time-lapse light microscopy has been challenging. The main goal of this project was to develop a reconstitution assay of Drosophila melanogaster fertilization enabling live microscopy. This implied the design of an ex vivo experimental approach in which a female pronucleus in a single droplet of cytoplasm is fertilized with a single sperm cell, and, in which both pronuclei and the associated cytoskeleton can be observed live at high resolution. To this end, eggs were harvested with precisely determined timing of female meiosis. In vivo imaging of non-fertilized eggs allowed to observe female meiosis completion. This knowledge will set the basis for the cytoplasmic isolation of the female pronucleus. Finally, it was possible to perform time-lapse imaging of pronuclear apposition and mitosis in the extract from recently fertilized eggs. This novel assay opens new avenues to study chromosomal dynamics during fertilization enabling more detailed insight, for example, into bacteria transmission and cytoplasmic incompatibility.}
Keywords: {pt=Drosophila melanogaster, Fertilização, Meiose, Microscopia, Pronúcleos, en=Drosophila melanogaster, Fertilization, Meiosis, Microscopy, Pronuclei}

Discussão: novembro 13, 2015, 14:0