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Dissertação

Plasmid DNA purification with synthetic protein-mimic affinity ligands EVALUATED

Detalhes: A purificação de plasmídeos é crucial no progresso da terapia génica e na produção de vacinas de DNA. A cromatografia de afinidade tem um papel importante neste empreendimento ao possibilitar a purificação de biomoléculas por interações seletivas com ligandos específicos. Apesar da elevada seletividade, os ligandos biológicos apresentam baixa capacidade de ligação, elevados custos de produção e fraco potencial de scale-up. Ligandos sintéticos podem ultrapassar estas desvantagens, sendo resistentes à degradação química e biológica e uma alternativa económica, mas a sua aplicação não foi descrita para purificação de plasmídeos. Num trabalho anterior, um ligando baseado na triazina, selecionado de uma biblioteca combinatorial com 22 elementos e imobilizado num suporte monolítico CIM® (ligando 6/5) foi considerado promissor na purificação de sc pDNA usando cromatografia de afinidade. Neste trabalho, para confirmar estes resultados, este suporte foi avaliado no sistema de purificação ÄKTA, em condições hidrófobas (usando (NH4)2SO4 no tampão de lavagem) e hidrófilas (com NaCl no tampão de eluição). No entanto, o ligando não permitiu purificar a isoforma superenrolada do plasmídeo pVAX1/lacZ. Alternativamente, outros ligandos de afinidade da biblioteca combinatorial sintetizada em Sepharose CL-6B, com composição distinta (hidrófoba e mista), foram selecionados e testados na purificação da isoforma superenrolada do mesmo plasmídeo. Após avaliação por cromatografia em bancada, os ligandos 2/1 e 8/1 foram considerados ligandos-líder, sendo posteriormente testados no sistema ÄKTA. Os melhores resultados foram obtidos para o ligando 2/1, em condições hidrófobas, em que se purificou a isoforma superenrolada com rendimento de recuperação de 75,1%.
Keywords: purificação de plasmídeos, pVAX1/lacZ cromatografia de afinidade, ligandos sintéticos de afinidade, Sepharose CL-6B, discos monolíticos CIM®

Discussão: dezembro 5, 2017, 17:0