Ficheiros necessários para o relatório
Caros alunos, Para a preparação do relatório do trabalho experimental de Southern blot os grupos devem utilizar para análise os seguintes resultados:
1) Gel referente à amplificação por PCR do gene pgmG - identificado por turno
2) Gel referente à restrição do DNA cromossómico- identificado por turno
3) Gel referente ao resultado obtido após purificação do produto PCR- identificado por turno e poço no gel
4) Membrana contendo o resultado da hibridação de Southern
Encontrarão nesta secção todos os ficheiros de que necessitam. À medida que concluírem a aula A4 (hibridação) ficará disponível o resultado da membrana.
Notas:
- O turno 2A deve utilizar as imagens do géis de agarose (quer de PCR, quer de DNA genómico) disponibilizadas no ppoint "Reference Gels TP3"
- Os turnos em que não haja sinal de hibridação nos 4 poços correspondentes às 4 enzimas de restrição devem utilizar, além da vossa membrana, a membrana do ppoint "Membrana-referencia" para a análise e discussão dos resultados.
Análise in silico do resultado expectável para a hibridação de Southern do gene pgmG
Para poderem verificar se os pesos moleculares das bandas que obtiveram na membrana estão de acordo com o esperado, podem fazer o mapa de restrição da região genómica que contém o gene pgmG.
Para isso sigam os seguintes passos:
1. Obtenham a sequência nucleotídica do gene pgmG a partir deste link (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF167367.1?&feature=CDS#feature_6103618_CDS_0). A sequência do gene pgmG está representada a castanho.
2. Numa nova janela do browser da Internet abram a página referente ao genoma de S. elodea (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=sphingomonas+elodea)
3. Verão uma secção que diz Tools. Cliquem na opção BLAST Genome.
4. Importem para o ecrã do BLAST a sequência nucleotídica do gene pgmG. Notem que no BLAST devem ter seleccionada a opção Draft Genomes (por default fica em complete genomes).
5. O resultado que obtém representa a região genómica onde está localizado o gene pgmG. O gene encontra-se localizado entre as posições 15,997 (STOP) 17,385 (START). No alinhamento de nucleótidos que obtém cliquem em Graphics.
6. Deverão fazer a análise do mapa de restrição de um fragmento contendo 15 kb a montante e 15kb a jusante do gene pgmG.
Para isso no alinhamento de nucleótidos que obtém cliquem em Graphics. Cliquem em Tools e depois em GoTo. Escolham as coordenadas que vos interessam. Para obterem a sequência dessa zona basta clicar em Tools, Download FASTA visible range.
7. Usem a sequência que obtiveram no NEB Cutter para obter o mapa de restrição desta região genómica para as enzimas de restrição, ou combinação de enzimas, que vocês usaram. Podem utilizar a opção custom digest para seleccionar as enzimas e depois a opção view gel para ver o tamanho dos fragmentos de restrição. Deverão avaliar qual o tamanho do fragmento de restrição onde estamos à espera que apareça a nossa sonda do pgmG.
Estejam à vontade para me contactar caso tenham alguma dúvida.
Bom trabalho,
Filipa Mendes
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