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Dissertação

Scalling-up ssDNA scaffold purification for DNA-origami nanostructures assembly EVALUATED

Detalhes: Nanoestruturas de DNA são produzidas pelo método “scaffolded DNA-origami” no qual uma cadeia simples e longa (~ 103 - 104 pares de bases) de DNA (ssDNA scaffolds) é dobrada com ajuda de pequenos oligonucleotídeos, numa nanoestrutura com formato pré-definido. O ssDNA mais usado é o genómico circular de M13mp18 composto por 7249 nucleótidos. Contudo, o método atualmente utilizado na purificação de ssDNA obtido do M13 é precipitação com etanol, que não é escalável nem seletiva. O objetivo do trabalho é o desenvolvimento de um método de purificação escalável de scaffolds produzidos através do bacteriófago M13 adequados para montagem de nanoestruturas de DNA. Produziu-se M13 em culturas de 500mL de E.coli em balões Erlenmeyer. Após colheita foi extraído o DNA por lise química com 200mM NaOH/1%SDS, seguida de neutralização com acetato. A purificação desenvolveu-se recorrendo a ultrafiltração, na qual membranas com diferentes tamanhos (10, 30, 50 ou 100kDa) foram avaliadas, seguida de cromatografia de permuta aniónica utilizando gradientes de eluição com concentração crescente de NaCl. No scale-up, o bacteriófago produziu-se num fermentador de 1,2L e após 24 horas os fagos foram recolhidos, o genoma extraído e de seguida filtrado num sistema TFF utilizando uma membrana com tamanho de poro 100kDa. Após filtração isolou-se o ssDNA por cromatografia de permuta aniónica sem perdas de ssDNA. A concentração final foi 5ng de ssDNA/L. Contrariamente ao método convencional, não se detetaram impurezas como proteínas ou DNA do hospedeiro no produto final. O ssDNA purificado utilizou-se na montagem da nanoestrutura, onde se testaram diferentes condições.
Keywords: ssDNA scaffolds, bacteriófago M13, DNA-origami, purificação, cromatografia permuta aniónica

Discussão: novembro 28, 2023, 14:30

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