Dissertação
Integrated bottom-up and middle-down approaches for structural characterization of proteins by Mass Spectrometry EVALUATED
Biofármacos são uma classe de medicamentos com substâncias ativas produzidas, extraídas ou semi-sintetizadas de fontes biológicas. Dentro das classes de biofármacos no mercado, a maioria é composta por proteínas terapêuticas. O presente trabalho teve como objetivo desenvolver e implementar várias ferramentas analíticas para caracterizar a estrutura de proteínas. Neste projeto, três proteínas modelo foram submetidas a diferentes condições de degradação, digeridas, e analisadas através de mapeamento peptídico, utilizando duas abordagens diferentes: bottom-up e middle-down. Para a análise de mapeamento peptídico, um método de Cromatografia Líquida de Fase Reversa (RP-HPLC) foi desenvolvido, utilizando uma abordagem de Analytical Quality by Design. Cromatografia Líquida-Espectrometria de Massa (LC-MS) foi utilizada para ter uma compreensão mais profunda das mudanças estruturais que ocorreram. Os resultados obtidos por mapeamento peptídico foram comparados com a análise da proteína intacta e Cromatografia de Exclusão Molecular (SEC), de forma a definir uma estratégia integrada para a caracterização proteica. Após o desenvolvimento do método de RP-HPLC, foi possível obter um mapa peptídico que permitiu identificar as modificações presentes nas proteínas submetidas a condições de degradação. A análise de SEC demonstrou ser uma estratégia pouco eficaz na deteção de pequenas modificações causadas pelas condições de degradação. Por fim, foi realizada uma análise de LC-MS, que possibilitou a identificação de diversos péptidos com modificações, assim como o seu peso molecular e sequenciamento parcial da estrutura primária. Por último, o protocolo de digestão proteica foi otimizado, de forma a reduzir o tempo de digestão, manipulando a temperatura e a quantidade de enzima utilizada.
novembro 30, 2021, 15:30
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Orientação
