Dissertação
Establishment of 293 based AAV packaging cell lines using shRNA-mediated rep silencing EVALUATED
O principal objetivo deste trabalho foi instituir os pilares para estabelecer linhas celulares de empacotamento de AAV baseadas em 293 contendo um mecanismo para controlar a citotoxicidade da Rep, através do silenciamento por shRNA e do sistema Cre/loxP. Quatro shRNAs direcionados para a rep foram desenhados e clonados individualmente entre sequências loxP. Na sua presença, a expressão de rep será silenciada. Após infeção com um adenovírus que expresse Cre (AdV-Cre), a sequência de shRNA deverá ser excisada, reconstituindo a expressão de rep. Este sistema foi testado em expressão transiente e estável e neste último por infeção com adenovírus. Em transiente, os níveis de rep foram semelhantes, independentemente da presença de shRNA. Na presença de rep, a expressão de cap foi 5 vezes superior. As populações estáveis apresentaram entre 0 e 1 cópia dos elementos genéticos do plasmídeo de empacotamento. A expressão de cap foi inferior à transiente. Após infeção com AdV-Cre, ocorreu amplificação de rep-cap na população controlo que expressa rep-cap (sem shRNA). No entanto, nas populações que expressam shRNA, os níveis de rep permaneceram baixos antes e após infeção. Assim, não foi possível validar a eficiência dos shRNAs. Neste trabalho conclui-se que será necessário integrar o rep em múltiplas cópias ou num locus de elevada expressão. Globalmente, esta tese contribuiu para estabelecer métodos essenciais, assim como para gerar conhecimento que serão utilizados no desenvolvimento de linhas produtoras de AAVs de elevadas produtividades, nomeadamente, através do aperfeiçoamento do desenho, seleção e entrega das cassetes de expressão de shRNAs e rep-cap.
janeiro 20, 2021, 9:30
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