Dissertação
Influence of lipid membranes on huntingtin exon 1 fibrillation EVALUATED
A Doença de Huntington (HD) é uma doença herdada neurodegenerativa causada pela expansão da repetição CAG no primeiro exão do gene da huntingtin (HTT). Expansões patológicas cima de um threshold 37 CAG levam à expressão da proteína huntingtin mutante (Htt) contendo um domínio poliglutamina (Q) expandido. O splicing aberrante e clivagem proteolítica das proteínas Htt mutantes resultam num fragmento altamente tóxico da Htt que engloba o exão 1 (Httex1), que é suficiente para reproduzir a HD. Estudos recentes apoiam que membranas biológicas promovem a agregação do Httex1.O objetivo deste projeto é estabelecer um protocolo para estudar a formação de fibras amiloides da Httex1 e avaliar o impacto de membranas lipídicas aniónicas. A agregação das variantes Httex1-37Q e Httex1-43Q foram avaliadas por ensaios de fluorescência com ThT. Inicialmente, a estratégia envolveu a produção de tag-free Httex1-37Q usando a SUMO-tag para solubilização. O ensaio de fluorescência com ThT revelou que a tag-free Httex1-37Q já estava agregada antes do início do ensaio. Portanto, a variante mutante Httex1-43Q foi purificada como proteína de fusão e o SUMO-tag só foi removido durante o ensaio ThT. A clivagem do tag é quase instantânea, evitando interferência no ensaio. A cinética de fibrilação da Httex1-43Q mostra o perfil de uma curva sigmoide e que as membranas lipídicas aniónicas potenciam a fibrilação, de acordo com literatura corrente. O nosso protocolo permite uma plataforma excelente para estudar a formação de fibras amiloides Httex1 em solução e na presença de membranas lipídicas, permitindo investigar diferentes variantes, concentrações, e composições lipídicas.
novembro 16, 2022, 14:0
Publicação
Obra sujeita a Direitos de Autor
Orientação
ORIENTADOR
Departamento de Bioengenharia (DBE)
Professor Auxiliar Convidado
ORIENTADOR
Ana Margarida Nunes da Mata Pires de Azevedo
Departamento de Bioengenharia (DBE)
Professor Auxiliar