Dissertação
Purification of Plasmid Minicircles Biopharmaceuticals by Combined Enzymatic and Chromatographic Techniques EVALUATED
Os plasmídeos são vectores promissores para a transferência de DNA em imunização e terapia. Estes vectores são constituídos por duas partes: unidade eucariótica e unidade bacteriana. A tecnologia de minicírculo foi desenvolvida para remover as sequências bacterianas através da recombinação em local específico, resultando em vectores seguros e eficientes para a transferência génica. O desenvolvimento de um método de purificação de minicírculo simples e robusto é dificultado pelas características do minicírculo e dos contaminantes (plasmídeo parental e miniplasmídeo), pois estes apresentam tamanhos semelhantes e propriedades físico-químicas muito idênticas (carga e hidrofobicidade). O principal objectivo deste trabalho foi desenvolver um processo simples, robusto, económico e escalável de produção de minicírculos. Neste estudo o minicírculo foi produzido na estirpe E.coli BWAA através da recombinação com ParA resolvase, sob o controlo de araC-pBAD, do pVAXmini. Os plasmídeos (plasmídeo parental, miniplasmídeo e minicírculo) foram purificados por lise alcalina, cromatografias de interacção hidrofóbica (HIC) e exclusão por tamanho (SEC). Os contaminantes foram posteriormente digeridos com endonucleases para a obtenção dos fragmentos lineares (preservando o minicírculo) e a separação destes do minicírculo foi efectuada com a combinação de diferentes técnicas. HIC (SourceTM15Phe4.6/100PE) e SEC (Superose6 10/300) foram usados para estudar o intervalo de tamanhos de fragmentos lineares que pode ser separado do minicírculo. A desnaturação térmica dos fragmentos lineares com o minicírculo seguida de renaturação selectiva do minicírculo superenrolado e HIC (SourceTM15Phe4.6/100PE) ou S1nuclease (que degrada as cadeias simples de DNA) foram também estudados. No entanto, nenhum destes métodos demonstrou ser apropriado para o nosso objectivo.
novembro 22, 2012, 14:0
Documentos da dissertação ainda não disponíveis publicamente
Orientação
CO-ORIENTADOR
Duarte Miguel De França Teixeira dos Prazeres
Departamento de Bioengenharia (DBE)
Professor Associado
