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Dissertação

Towards the miniaturization of cell assays for GPCR monitoring EVALUATED

Detalhes: Os Recetores Acoplados à proteínaG (GPCRs) são um grupo de proteínas de membrana que revelam um papel chave nos processos de transdução de sinal sendo apontado a estas proteínas um enorme potencial para a descoberta de fármacos. As mais modernas tecnologias utlizadas para encontrar fármacos são normalmente baseados em ensaios de elevada capacidade (HTS) utilizando células vivas, nomeadamente ensaios de cálcio. Uma das estratégias de miniaturização mais populares é a utilização de microfluidos. Nesta tese, foi caracterizada a resposta do recetor endógeno M1 de células HEK 293 utilizando uma técnica baseada em microscopia e imaging. Foi observada a ativação e o comportamento dose resposta ao agonista carbamylcholine nas concentrações de 1x106 - 1mM. Com o antagonista pirenzepine foi possível observar o fenómeno de inativação, mas não foi não foi detetado nenhum comportamento dose resposta. Foi utilizado um método com a capacidade de seguir a fluorescência ao longo do tempo de células individuais para elucidar alguns aspetos relacionados com a minituriazação. A observação do sistema focando células individuais resulta na possibilidade de obter resultados mais sensíveis.No entanto a heterogeneidade da população celular é um obstáculo a miniaturização do sistema tendo sido definido o número mínimo de células para a obtenção de dois cenários: um de ativação média (49 células) e outro para um sinal altamente sensível (106 células) Para construir uma linha celular baseada em HEK 293T exprimindo a proteína bioluminescente aquarina. Foi clonada uma sequência termostável a 37ºC desta num plasmídeo de transfeção constitutiva de HEK 293T, o pcDNA 3.1.
Keywords: Receptores Acoplados à Proteína G, Miniaturização de ensaios celulares, Ensaios de elevada capacidade, Imaging quantitativo de fluorescência, Aquarina

Discussão: novembro 21, 2011, 11:0

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