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Dissertação

A CRISPR interference toolkit for studying X-chromosome inactivation in human female embryonic stem cells EVALUATED

Detalhes: A inativação do cromossoma X (XCI) é um mecanismo epigenético de compensação de dosagem gênica que iguala a expressão dos genes ligados ao cromossoma X entre as mulheres (XX) e os homens (XY). Os conhecimentos atuais sobre este mecanismo foram essencialmente elucidados através de estudos com o modelo do ratinho, e podem não se traduzir totalmente em seres humanos. Para colmatar esta lacuna, foi desenvolvido um sistema de interferência CRISPR (CRISPRi) em células estaminais embrionárias femininas humanas (hESCs) para reduzir individualmente a expressão de dois fatores-chave da XCI: XIST, um RNA longo não codificante expresso exclusivamente a partir do cromossoma inativo que induz um silenciamento transcricional em toda a sua extensão; e SPEN, um repressor de transcrição recrutado pelo XIST, que desempenha um papel fundamental no processo de inativação. Para tal, a partir de uma população inicial de hESCs concebida para expressar uma cassete CRISPRi induzível por doxiciclina, foi estabelecida uma linha homogénea, H9 dCas9-KRAB, com forte indução do sistema CRISPRi e um XCI estável. Em seguida, foram construídos dois sistemas de vetores multi-gRNA para transportar individualmente três gRNAs concebidos para cada gene. Estes vetores foram integrados com êxito no genoma de hESCs H9 dCas9-KRAB através de integração por transposição. Após ativação do sistema CRISPRi com doxiciclina por 48 horas, embora o SPEN não tenha sido alterado, uma análise por RNA-FISH confirmou uma redução da expressão de XIST. Este sistema tem o potencial de servir como uma ferramenta versátil para investigações aprofundadas sobre os mecanismos que regem a XCI humana.
Keywords: Inativação do cromossoma X, células estaminais embrionárias humanas, CRISPRi, XIST, SPEN

Discussão: novembro 29, 2023, 14:0

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