Dissertação
Expression and purification of the Streptococcus pyogenes Cas9 protein for ribonucleoprotein transfection strategy and CRISPR/Cas9-based in AAVS1 safe harbor locus EVALUATED
“Mesenchymal Stem Cells” (MSCs) apresentam baixa imunogenicidade e tropismo tumoral, características essenciais para as transformar em veículos transportadores de agentes anticancerígenos, usando edição genética. Azurina é uma proteína bacteriana capaz de reduzir a replicação e induzir apoptose em células tumorais sem efeitos secundários conhecidos nas células normais. Se geneticamente modificadas para produzir azurina, as “MSCs” poder-se-iam tornar uma ferramenta terapêutica contra a tumurigénese. Atualmente, a ferramenta de edição genómica com maior eficiência e especificidade é o CRISPR-Cas9. Infelizmente, quando células são expostas a este complexo por longos períodos, a chance de “off-targeting” aumenta. Assim, produziu-se in vitro o complexo para edição eficiente no “genomic-safe-harbor” AAVS1, e para diminuir o tempo de de residência intracelular. A produção e purificação de Cas9 optimizada resultou numa maior quantidade e pureza de Cas9, usando culturas de E. coli a 25⁰C com 0.2mM IPTG para indução de super-expressão. A eficiência de clivagem da ribonucleoproteina foi testada in vitro em ADN de células ”MSCs”, “HEK”, HeLa, e em HEK transfectadas por lipofecção. O sucesso da clivagem da cadeia dupla do ADN foi observada usando o Kit de Deteção de Clivagem “GeneArtTM Genomic”. Esta estratégia pode ser preferível à modificação das “MSCs” que apresentam baixa edição genómica por plasmídeo único, devido à sensibilidade à seleção com puromicina. Apesar da otimização da microporação (condições ótimas: um pulso,1400V e 1300V, 30ms), as células não resistem à seleção, reforçando a necessidade de obter elevados níveis de Cas9 para estudos futuros de variabilidade entre dadores e tecidos de origem das “MSCs”.
novembro 16, 2018, 9:30
Publicação
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Orientação
ORIENTADOR
Cláudia Alexandra Martins Lobato da Silva
Departamento de Bioengenharia (DBE)
Professor Auxiliar
