Ficheiros necessários para o relatório

Caros alunos, 

Para a preparação do relatório do trabalho experimental de Southern blot  (TP3) os grupos devem utilizar para análise os seguintes resultados:

1) Gel referente à amplificação por PCR do gene pgmG - identificado por turno

2) Gel referente à restrição do DNA cromossómico- identificado por turno

3) Gel referente ao resultado obtido após purificação do produto PCR-  identificado por turno e poço no ppoint em anexo ("produtos PCR purificados")  

4) Membrana contendo o resultado da hibridação de Southern (A5)


Encontrarão nesta secção todos os ficheiros de que necessitam. À medida que concluírem a aula A5 (hibridação) ficará disponível o resultado da membrana.

Notas: 

- Os turnos  que não têm ficheiros dos geis realizados na aula 4 (quer de PCR, quer de DNA genómico) (2A, 2C, 2D e 3A) podem usar as imagens disponibilizadas no ppoint "Reference Gels TP3" 

- Os alunos do turno 2B, 2D, 4A e 3B devem utilizar, além da vossa membrana, a membrana do ppoint "Membrana-referencia" para a análise e discussão dos resultados.

Turnos 3B e 4B- só conseguirei colocar no fenix a vossa membrana na 6ª feira- no entanto não tiveram sinais de hibridação suficientemente fortes para analisar  há sinais mas demasiados fracos para conseguirem analisar com rigor), por isso devem usar a membrana de referência 



Análise in silico do resultado expectável para a hibridação de Southern do gene pgmG

Para poderem verificar se os pesos moleculares das bandas que obtiveram na membrana estão de acordo com o esperado, podem fazer o mapa de restrição da região genómica que contém o gene pgmG.

Para isso sigam os seguintes passos:

1. Obtenham a sequência nucleotídica do gene pgmG a partir deste link (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF167367.1?&feature=CDS#feature_6103618_CDS_0). A sequência do gene pgmG está representada a castanho.

2. Numa nova janela do browser da Internet abram a página referente ao genoma de S. elodea (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=sphingomonas+elodea)

3. Verão uma secção que diz Tools. Cliquem na opção BLAST Genome.

4. Importem para o ecrã do BLAST a sequência nucleotídica do gene pgmG. Notem que no BLAST devem ter seleccionada a opção Draft Genomes (por default fica em complete genomes).

5. O resultado que obtém representa a região genómica onde está localizado o gene pgmG. O gene encontra-se localizado entre as posições 15,997 (STOP) 17,385 (START). No alinhamento de nucleótidos que obtém cliquem em Graphics.

 6. Deverão fazer a análise do mapa de restrição de um fragmento contendo 15 kb a montante e 15kb a jusante do gene pgmG.

Para isso no alinhamento de nucleótidos que obtém cliquem em Graphics. Cliquem em Tools e depois em GoTo. Escolham as coordenadas que vos interessam. Para obterem a sequência dessa zona basta clicar em Tools, Download FASTA visible range.

 7. Usem a sequência que obtiveram no NEB Cutter para obter o mapa de restrição desta região genómica para as enzimas de restrição, ou combinação de enzimas, que vocês usaram. Podem utilizar a opção custom digest para seleccionar as enzimas e depois a opção view gel para ver o tamanho dos fragmentos de restrição. Deverão avaliar qual o tamanho do fragmento de restrição onde estamos à espera que apareça a nossa sonda do pgmG.

 

Estejam à vontade para me contactar caso tenham alguma dúvida.

Bom trabalho,

Filipa Mendes

 

 

 

 

 

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