Dissertação

{en_GB=Detection of Dengue vírus using optomagnetic detection technology and centrifugal microfluidics} {} EVALUATED

{pt=O vírus de Dengue e Zika são uma preocupação de saúde pública. Nos últimos 50 anos, incidência aumentou 30 vezes, estimando-se que entre 50-100 milhões de infecções aparecem anualmente. Estes vírus são transmitidos por mosquitos Aedes, encontrados em países tropicais/subtropicais. Estas regiões são pobres em recursos e as condições para diagnóstico e prevenção estão em defeito. Portanto, há grande demanda por tecnologias custo-eficientes sensíveis para point-of-care biossensores. Loop-mediated isothermal amplification é uma poderosa técnica de amplificação molecular, específica para uma sequência de ADN/ARN. É aqui demonstrado a integração deste método com tecnologia de biossensores optomagnéticos, incorporada em uma abordagem state-of-the-art para manipulação de fluidos em uma plataforma microfluídica centrífuga. A colaboração entre Denmark Technical University e Blusense Diagnostics, uma start-up biotecnológica , permitiu o desenvolvimento de protocolos optimizados para a detecção de vírus usando uma avaliação "end-point" e uma "real-time" monitorização da reacção. Mostra-se que após 30 minutos, o ensaio "end-point" permite detecção de 100aM Dengue-2 sintético, correspondente a 6000 moléculas de ADN, em 30μL volume total de reacção. Na abordagem "real-time" implementada, após 20 minutos de reacção é possível detectar 300aM de ADN Dengue-2, em 100μL de mistura. A detecção de amostras virais de ARN é validado, que, juntamente com um design microfluídico para separação de amostra, abre o caminho para incorporar totalmente extracção genómica, preparação de amostras, reacção e detecção para diferenciação de vírus em um sistema de baixo-custo miniaturizado e multifuncional., en=Dengue and Zika virus are nowadays a major public health concern. Within the last 50 years, incidence has increased 30-fold, estimating that 50-100 million infections appear annually. These viruses are transmitted by Aedes mosquitoes, found in tropical/subtropical countries. In these poor-resource regions, conditions for expensive diagnostic and preventive protocols are defective. Hence, there is great demand for sensitive, cost-efficient and point-of-care biosensor technologies, capable of detecting virus at molecular level. Loop-mediated isothermal amplification is a powerful molecular technique, highly specific for a DNA/RNA sequence. It is demonstrated for the first time, in this work, integration of this amplification method with optomagnetic biosensor technology, and incorporation in a centrifugal microfluidic system to realize a low-cost point-of-care platform for molecular detection. This project, in collaboration with Denmark Technical University and Blusense Diagnostics, a biotech start-up, initiated the development of optimized protocols for detection of viruses, using end-point assessment and real-time monitoring of LAMP reaction. It is shown that after 30 minutes, the end-point amplification assay allows detection of down to 100aM of Dengue-2 synthetic target, corresponding to 6000 molecules of viral DNA, in 30μL total volume. Moreover, a Real-Time approach was implemented, where within 20 minutes of reaction it is possible to detect 300aM of Dengue-2 DNA, in 100μL of LAMP mixture. Furthermore, extracted RNA viral samples detection is validated using this readout, which together with a microfluidic design for sample splitting, paves the way to fully incorporate genomic extraction, sample preparation, reaction and detection for virus differentiation in low-cost multifunctional systems. }
{pt=Vírus de Dengue, Diagnóstico Point-of-Care, Loop-mediated Isothermal Amplification, Nanopartículas Magnéticas, Microfluídica Centrífuga, en=Dengue Virus, Point-of-Care Diagnostics, Loop-mediated Isothermal Amplification, Magnetic Nanoparticles, Centrifugal Microfluidics}

Novembro 25, 2016, 16:0

Publicação

Obra sujeita a Direitos de Autor

Orientação

ORIENTADOR

João Pedro Estrela Rodrigues Conde

Departamento de Bioengenharia (DBE)

Professor Catedrático

ORIENTADOR

Marco Donolato

Blusense Diagnostics

Doutor