Dissertação

{en_GB=Generating isogenic NPC1 hiPSC lines for disease modelling using the CRISPR/Cas9 system} {} EVALUATED

{pt=CRISPR/Cas9 é uma ferramenta poderosa e versátil para edição genética. Neste trabalho, esta ferramenta foi aplicada para gerar linhas de NPC1 isogénicas para modelar a doença de Niemann-Pick tipo C (NPC) a partir de células humanas pluripotentes induzidas (hiPSCs). O objetivo era introduzir uma mutação específica chamada de substituição I1061T, que ocorre no exão 21 do gene NPC1. Para tal, as hiPSCs foram transfetadas com um plasmídeo Cas9-GFP, um vetor de expressão do RNA guia e um oligonucleótido para servir como molde para reparação por recombinação homóloga (HDR). O molde inclui a substituição I1061T e duas mutações de bloqueio localizadas no motivo adjacente ao protoespaçador (PAM), que é necessário para o reconhecimento pelo sistema CRISPR/Cas9. As mutações de bloqueio integram a nossa estratégia para aumentar o número de hiPSCs corretamente editados ao reduzir reedições pela Cas9. Dos 62 clones que foram expandidos com sucesso, apenas 3 tinham mutações no locus de interesse segundo a análise feita por sequenciação pelo método de Sanger. Adicionalmente, nenhum destes 3 clones incorporou o molde de HDR, apresentando antes mutações aleatórias resultantes de reparação por união de extremidades não-homólogas (NHEJ). De especial interesse é um clone com uma mutação que causa um final prematuro da expressão proteica e que poderá ser útil como um nocaute de NPC1. No geral, os resultados obtidos não foram ideais, mas estamos confiantes que o trabalho realizado contribuiu para o avanço de futuros desenvolvimentos na modelação da doença de NPC em humanos., en=CRISPR/Cas9 is a powerful and versatile gene-editing tool. In this work we applied this tool to generate isogenic NPC1 hiPSC lines for disease modelling of Niemann-Pick type C disease. Our aim was to introduce a specific point mutation termed I1061T substitution, which occurs in exon 21 of the NPC1 gene. In order to do that the hiPSCs were transfected with a Cas9-GFP plasmid, an expression vector for the single-guide RNA (sgRNA) and a single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) to serve as the homology-directed repair (HDR) template. The template included the I1061T substitution and two blocking mutations located on the protospacer adjacent motif (PAM), which is necessary for recognition by the CRISPR/Cas9 machinery. The blocking mutations were part of our strategy to increase the number of correctly-edited hiPSCs by reducing re-cutting by the Cas9. Out of the 62 clones that were successfully expanded only 3 showed mutations in the locus of interest, as determined by Sanger sequencing. Additionally, these 3 mutated clones did not incorporate the HDR template, but instead presented random mutations (indels), which is sign of DNA repair by non-homologous end joining (NHEJ). Of particular interest is a clone that presented a frameshift insertion which causes a premature stop of protein expression, as it might prove useful as an NPC1 knockout. Overall, the results obtained were not ideal, but we are confident that this work contributed to the advancement of future developments of NPC human disease modelling.}
{pt=CRISPR/Cas9, edição genética, reparação por recombinação homóloga, células humanas pluripotentes induzidas, NPC1, modelação de doenças, en=CRISPR/Cas9, gene-editing, homology-directed repair, human induced pluripotent stem cells, NPC1, disease modelling}

Novembro 22, 2018, 15:0

Publicação

Obra sujeita a Direitos de Autor

Orientação

ORIENTADOR

Tiago Paulo Gonçalves Fernandes

Departamento de Bioengenharia (DBE)

Professor Auxiliar

ORIENTADOR

Evguenia Pavlovna Bekman

SCERG (iBB) e MCFonseca Lab (iMM)

Doutora