Dissertação

{en_GB=Engineering of smart exosomes for clearance of Abeta amyloid protein in Alzheimer’s disease} {} APPROVED

{pt=Atualmente, a Doença de Alzheimer (DA) é o principal tipo de demência, mundialmente. Apesar de os mecanismos subjacentes à sua patogénese ainda não serem totalmente conhecidos, o conhecimento atual suporta a ideia de um papel central do péptido A na mediação da patogénese da doença. Contudo, e apesar da gravidade da doença, os tratamentos existentes não conseguem prevenir ou adiar a sua progressão, sendo necessárias novas abordagens para enfrentar a problemática da agregação de A. A introdução de enzimas exogéneas com atividade proteolítica contra A representa uma alternativa possível. Porém, devido à falta de especificidade contra A, estas estratégias não são utilizadas. Assim, alcançar estratégias de modificação para exossomas, vesículas com capacidade de atravessar a barreira hematoencefálica, para permitir a entregar de Neprilisina (NEP) de maneira específica ao cérebro apresenta-se como uma abordagem terapêutica atraente e inovadora. Aqui, caracterizou-se as propriedades funcionais e estruturais de exossomas carregados com NEP, que posteriormente serão usados para o desenvolvimento de específicos veículos para a entrega de enzima. Utilizando uma metodologia baseada em precipitação, isolou-se com sucesso vesículas extracelulares (VEs) de células HEK293T com tamanhos iguais não só a exossomas, mas também a outros tipos de vesículas. Recorrendo a técnicas de espectroscopia, confirmou-se a presença de NEP nas amostras de VEs isolados de células que foram previamente transfectadas com a enzima. A atividade dessas vesículas contra A 1-42 foi analisada usando A 1-42 marcado e não marcado. A fibrilação de A 1-42 foi significativamente inibida pelas vesículas. , en=Currently, Alzheimer’s Disease (AD) is the most common type of dementia, worldwide. Although the mechanisms responsible for its development are still not understood, available data strongly supports a central role of A peptide in mediating AD pathogenesis. Despite its gravity, available therapies cannot prevent, or delay AD’s progression and a new approach is necessary to tackle the issue of A aggregation. Introduction of exogeneous A-proteolytic enzymes is a possible alternative. However, given the lack of specificity of these enzymes towards A, such strategy has not been pursued. In this regard, achieving modification strategies for exosomes (vesicles with the ability to cross the blood-brain barrier), to allow for delivery of Neprilysin (NEP) in a specific manner to the brain is particularly appealing as an innovative therapeutic approach. Here, we characterize the functional and structural properties of exosomes carrying NEP, to be used for the development of targeted vehicles for delivery of the enzyme. Employing a precipitation-based methodology we successfully isolated extracellular vesicles (EVs) from HEK293T cells, obtaining samples of vesicles with sizes within the range of exosomes and different extracellular vesicles. Resorting to spectroscopy techniques it was possible to confirm the presence of NEP in the samples of EVs isolated from cells that were previously transfected with the enzyme. The proteolytic activity of these vesicles against A1-42 peptide was also analysed, and we observed that fibrillation of A1-42 was significantly inhibited by EVs loaded with NEP.}
{pt=Doença de Alzheimer, proteína beta amiloide, exossomas, Neprilisina, vesiculas extracelulares., en=Alzheimer’s Disease, amyloid beta protein, exosomes, neprilysin, extracellular vesicles.}

Orientação

ORIENTADOR

Fábio Monteiro Fernandes

Departamento de Bioengenharia (DBE)

Professor Auxiliar Convidado

ORIENTADOR

Cláudia Alexandra Martins Lobato da Silva

Departamento de Bioengenharia (DBE)

Professor Auxiliar