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Dissertação

{en=Electrokinetic and optical detection of nucleic acids for biomedical diagnosis in microfluidics} {} EVALUATED

Detalhes: {pt=Os microRNAs são RNAs endógenos, com cerca de 22 nucleótidos, que têm papéis regulatórios importantes nas células. Estes agentes biologicamente activos foram detectados em circulação, podendo ser usados como biomarcadores de diversas doenças. O sistemas lab-on-a-chip podem ser decisivos na análise de microRNAs na prática clínica. Nesta tese, foi explorado um princípio de detecção eléctrico, sem marcação, para a detecção de ácidos nucleicos em microfluídica. Os microcanais foram fabricados em PDMS e selados contra vidro onde previamente foram depositados eléctrodos planares, permitindo realizar medições electrocinéticas e de fluorescência. Provou-se que as medições de potencial e corrente de streaming são adequadas para a descrição da carga eléctrica global do canal. Os potenciais ζ calculados variaram entre -67 mV (água desionizada) e - 4.6 mV (100 mM PB), num canal não funcionalizado. Para a detecção de DNA alvo, o microcanal foi tratado com APTES, sonda de ssDNA e bloqueado com BSA. Depois da imobilização da sonda, a sua densidade superficial era 2.09x10^4 µm-2 (15.7% de uma monocamada densa) e, depois do passo de bloqueio, 9.71x10^3 µm-2 (7.3% de uma monocamada densa). Usando uma amostra de 16 nL, as correntes de streaming permitiram detectar 5 µM de DNA alvo (com a sequência do miR-122) e distingui-lo de um controlo negativo (com a sequência do miR-375). As medições de fluorescência permitiram detectar 500 nM de DNA alvo. Finalmente, é apresentada uma lista de sugestões, de modo a melhorar a sensibilidade e especificidade do método e integrá-lo num sistema de análise miniaturizado., en=microRNAs are endogenous RNAs with a length of about 22 nucleotides that can play important regulatory roles in the cells. The recent discovery of circulating miRNAs has opened the possibility to study this class of biologically active agents as biomarkers of disease. Lab-on-a-chip systems may play a decisive role in the profiling of microRNAs for point-of-care diagnostic purposes. This thesis explores an electrical, label-free detection principle for microfluidic detection of nucleic acids. PDMS microchannels were sealed against glass where planar electrodes were previously deposited on. This microfluidic system allowed for electrokinetic and fluorescence measurements. Transient streaming current and potential measurements proved to be accurate in describing the overall electrical surface charge of the channel. For a bare channel, ζ-potential values varied between -67 mV (DI Water) and - 4.6 mV (100 mM PB). In order to recognize the target DNA, the microchannels were functionalized with APTES, ssDNA probe and blocked with BSA. After probe immobilization, the probe density on the surface was 2.09x10^4 µm-2 (15.7% of a dense monolayer) and, after the blocking step, it dropped to 9.71x10^3 µm-2 (7.3% of a dense monolayer). Using a 16 nL sample, streaming current measurements allowed to detect 5 µM of target DNA (miR-122 sequence) and distinguish it from a negative control (miR-375 sequence), while the fluorescence measurements detected down to 500 nM target DNA. A considerable number of enhancements are suggested in order to improve the sensitivity and specificity of the method and to integrate it on a micro total analysis system.}
Keywords: {pt=corrente de streaming, fluorescência, microfluídica, microRNA, DNA, sem marcação, en=DNA, fluorescence, label-free, microfluidics, microRNA, streaming current}

Discussão: junho 27, 2014, 9:30