Dissertação

{en=Purification of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cells for Regenerative Medicine Applications} {} EVALUATED

{pt=As Células Estaminais Pluripotentes humanas induzidas (hiPSC) têm enormes aplicações em Medicina Regenerativa, na descoberta de medicamentos e na modelação de doenças. As doenças neurológicas, em particular, poderão beneficiar da obtenção de Precursores Neurais (células com uma capacidade ilimitada de auto-renovação e de diferenciação em todos os subtipos neurais) a partir de hiPSC. No entanto, a incapacidade de gerar populações de Precursores altamente puras, sem hiPSC, após os protocolos de diferenciação neural impõe um obstáculo a estas duas últimas aplicações, por requerirem que o tecido adulto seja reproduzido com exactidão, bem como à sua utilização clínica, já que uma única hiPSC é capaz formar um teratoma. Contra este obstáculo, quatro tecnologias de separação celular foram avaliadas na sua capacidade de purificar as misturas obtidas após comprometimento neural: 1) Separação baseada em adesão, cuja resolução se revelou insuficiente 2) Eliminação Química, capaz de eliminar hiPSC desde que na ausência de outras células; 3) Separação Celular Magnética (com duas colunas), com eficiências médias de separação de cerca de 83% (células Tra-1-60+) e (96% colónias Oct4+ replaqueadas); 4) Cromatografia de Afinidade com criogéis de Poli-(vinil-alcoól) – cuja penetração celular foi caracterizada em termos de volume de injecção, fluxo, número e diâmetro celular; e relacionada com as propriedades microestruturais do criogel obtidas por microscopia confocal, criando as bases para as próximas etapas deste trabalho, ainda em desenvolvimento. Apesar de nenhuma das técnicas ter atingido os graus de pureza desejados, os dados e conhecimento recolhidos constituem um bom contributo para desenvolvimentos futuros., en=Generating human Induced Pluripotent Stem Cells (hiPSC) and hiPSC-derived cells is a recent technology with promising applications in Regenerative Medicine, Disease Modelling and Drug Screening. Neurological diseases could benefit greatly from this technology, since it enables deriving, from hiPSC, Neural Precursors, cells with a unlimited self renewal ability that can be differentiated into all nervous system cell types. A major obstacle is the inability to generate, after neural commitment protocols, highly pure Neural Precursor populations, which invariably contain enduring hiPSC. This hinders drug screening and disease modelling as developed tissue must be closely mimicked. Moreover, since hiPSC form teratomas when injected in mice, cell mixtures containing hiPSC cannot be considered safe for clinical applications. To address this issue, four Stem Cell Separation Technologies were evaluated for purification of cellular mixtures obtained after the Dual-SMAD neural commitment protocol: 1) Adhesion-based cell separation, whose resolution was proven too low; 2) Chemical Depletion, successfully eliminating hiPSC alone but not in co-culture, still under optimization; 3) Two-column Magnetically Activated Cell Sorting, with average separation efficiencies around 83% for Tra-1-60+ cells and 96% for replated Oct4+ colonies; 4) Affinity Chromatography using Poly-(vinyl-alcohol) cryogels – whose cellular breakthrough was characterized in terms of injection volume, flow rate, cell number and diameter; and related to the cryogel microstructure obtained by confocal microscopy, laying the ground for the next stage of the work, still under development. Although no single technique matched the desired performance, the wealth of gathered data and insights constitutes a good contribution for future breakthroughs. }
{pt=Cromatografia por Afinidade, Células Plutipotentes Induzidas Humanas, Células Precursoras Neurais, Separação Celular Magnética por Afinidade, Purificação de Células Estaminais, Criogel supermacroporoso, en=Affinity Chromatography, Human Induced Pluripotent Stem Cells, Neural Precursor Cells, Magnetic Activated Cell Sorting, Stem Cell Purification, Supermacroporous Cryogel}

dezembro 10, 2013, 10:0

Orientação

CO-ORIENTADOR

Joaquim Manuel Sampaio Cabral

Departamento de Bioengenharia (DBE)

Professor Catedrático

ORIENTADOR

Maria Margarida Fonseca Rodrigues Diogo

Departamento de Bioengenharia (DBE)

Equip.Prof.Auxiliar Convidado