Dissertação
{en=Culture Platform for Induction of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Cortical Neural Stem and Progenitor Cells under Chemically Defined Conditions} {} EVALUATED
{pt=A recente descoberta de que células somáticas podem ser reprogramadas num estado indiferenciado pela expressão de quatro factores de transcrição resultou numa nova fonte de células estaminais pluripotentes (PSCs). Esta é uma ferramenta útil na descoberta de novos fármacos, no estudo e tratamento de doenças (neurodegenerativas e outras), possibilitando terapias direcionadas para o paciente. No entanto, a actual falta de protocolos eficientes e reprodutíveis de diferenciação de PSCs humanas induzidas (hiPSCs) em tipos de células específicos, que não usem materiais de origem animal e corpos embrióides para a indução neural constitui um desafio a superar. Neste estudo foi optimizado um sistema baseado em cultura aderente para expansão e indução de hiPSCs em células estaminais corticais e células progenitoras, seguindo o protocolo de dupla inibição da via SMAD, usando as pequenas moléculas SB-431542 e dorsomorphin/LDN-193189. As células obtidas foram caracterizadas por imunofluorescência, citometria de fluxo e RT-PCR. Em todas as condições ocorreu formação de rosetas neurais relembrando a formação do tubo neural. Células derivadas de hiPSCs cultivadas em meio N2B27 mostraram uma maior diferenciação em células da neuroectoderme Pax6-positivas e Oct4-negativas comparativamente às que foram cultivadas no tradicional meio KO-DMEM/SR. Para além disso, de forma a determinar se os substratos MatrigelTM e laminina poderiam ser substítuidos por substratos não xenogeicos, a matriz sintética SynthemaxTM foi usada e suportou a expansão e diferenciação de hiPSCs. A diferenciação destes progenitores neurais gerou neurónios Tuj1 e MAP2-positivos, e astrócitos GFAP-positivos. Resutados comparáveis foram obtidos com duas linhas celulares, demonstrando a robustez do método apresentado., en=The discovery of Yamanaka’s research group that somatic cells can be reprogrammed into an undifferentiated state by the expression of four transcription factors represents a new source of pluripotent stem cells (PSCs). This holds a great promise as a tool for drug discovery, disease modeling and neurodegenerative and other disorders treatment, widening the possibility of patient-specific cell therapies. However, the current lack of reproducible and efficient protocols for human induced PSCs (hiPSCs) differentiation into specific cell types, free from animal-derived compounds and from the use of embryoid bodies for neural induction is a challenge to overcome. Here it is reported the development and optimization of a monolayer-based culture system for hiPSCs expansion and induction into cortical neural stem and progenitor cells via dual-SMAD inhibition protocol, using SB-431542 and dorsomorphin/LDN-193189 small molecule inhibitors. The generated neural precursors were characterized by immunocytochemistry, flow cytometry and RT-PCR, in order to disclose their neural identity. In all experimental conditions neural rosettes were formed, resembling neural tube formation. hiPSC-derived cells cultured in N2B27 medium showed improved conversion into Pax6-positive and Oct4-negative neuroectodermal cells, comparing to the standard used KO-DMEM/SR-based differentiation medium. Besides, aiming to determine whether MatrigelTM and laminin could be replaced by xeno-free synthetic matrices, SynthemaxTM was used and proved to be well-suited for hiPSCs expansion and differentiation. Long-term cultivation of neural progenitors was able to give rise to Tuj1 and MAP2-expressing neurons and GFAP-positive astrocytes. Similar results were obtained among two different hiPSC lines, demonstrating the robustness of the method.}
dezembro 10, 2013, 14:0
Orientação
CO-ORIENTADOR
Departamento de Bioengenharia (DBE)
Professor Catedrático
ORIENTADOR
Maria Margarida Fonseca Rodrigues Diogo
Departamento de Bioengenharia (DBE)
Equip.Prof.Auxiliar Convidado