Dissertação
{en=Genetic engineering of synovial-derived mesenchymal stem cells for cartilage regeneration} {} EVALUATED
{pt= A cartilagem articular é frequentemente danificada como resultado de lesões ou doenças degenerativas como a osteoartrite e artrite reumatóide. A sua limitada capacidade de auto-regeneração juntamente com a incapacidade das metodologias actuais em originar tecido cartilaginoso semelhante ao nativo motivou o interesse por terapias usando células estaminais. As células estaminais derivadas da membrana sinovial (SMSC) constituem uma abordagem prometedora para a regeneração da cartilagem, principalmente devido à sua maior capacidade de proliferação e superioridade para condrogénese. O papel da BMP4 como estimulador condrogénico foi comprovado in-vitro and in-vivo. Portanto, a modificação genética de SMSC usando vectores não virais para promover uma expressão transiente de BMP4 poderá aumentar a sua capacidade condrogénica, sem afectar a viabilidade e proliferação celular. Minicírculos (vectores de DNA desprovidos de sequências bacterianas) e plasmídeos contendo o gene BMP4 foram produzidos e purificados para posterior lipofecção em SMSC. Foi quantificada uma pureza de ≈88% para os minicírculos produzidos, o que afectou a eficiência de transfecção. As SMSC foram também transfectadas com vectores codificando para GFP, verificando-se que estas mantiveram a expressão de GFP durante mais de uma semana, com eficiências de transfecção de ≈30% viabilidades superiores a 90%. Além disso, SMSC expressando BMP4 cultivadas como pellets ou como agregados celulares utilizando o protocolo de Hanging Drop, originaram condrócitos normais. Em suma, a manipulação genética de SMSC de um modo transiente através do uso de métodos não-virais, provou ser uma estratégia promissora para futuras aplicações clínicas no âmbito da regeneração da cartilagem. , en=Articular cartilage is frequently damaged as result of trauma or degenerative conditions, such as osteoarthritis and rheumatoid arthritis. Its limited regenerative capacity together with the inability of current methodologies to originate native-like tissue for long-term applications increased the interest in stem cell-based therapies. Synovial-derived stem cells (SMSC) are an encouraging approach for cartilage regeneration and repair, mainly due to their higher proliferation ability and superiority for chondrogenesis compared to other MSC sources. BMP4 is a signaling molecule which role as chondrogenic stimulator has been proved both in-vitro and in-vivo. Therefore, genetic engineering of SMSC using non-viral DNA-vectors to promote a transient and sustained BMP4-expression may increase their chondrogenic capacity, without adverse effects on cell viability and proliferation. Accordingly, novel DNA-vectors lacking bacterial backbone (Minicircles) and conventional plasmids encoding for BMP4 gene were produced and purified for further liposome-mediated transfection into SMSC. Minicircles ≈88% pure, quantified by ImageJ® software, were obtained, which compromised transfection efficiency. Additionally, SMSC transfected with GFP-encoding plasmid vectors maintained gene expression over more than one week and presented high cell viabilities(≈90%) and recoveries(≈70%) while percentage of transfected cells and transfection yields reached a maximum of ≈32% and ≈25%, respectively, 24 hours after transfection. Moreover, BMP4-expressing SMSC cultured as pellets or as cell aggregates using a Hanging Drop protocol successfully differentiated into chondrocytes. Overall, this pioneer approach to genetically modify SMSC in a transient way through safer non-viral methods proved to be a promising strategy for use in cartilage regeneration clinical settings. }
dezembro 12, 2013, 18:0
Orientação
CO-ORIENTADOR
Departamento de Bioengenharia (DBE)
Professor Catedrático
