{en=Establishment of mouse Embryonic Stem cell lines with a reporter of Dll1 activity} {} EVALUATED

Detalhes: {pt=Este trabalho tem como objectivo gerar uma linha celular transgénica de células estaminais embrionárias de ratinho contendo um repórter fluorescente com o intuito de visualizar a actividade do gene Dll1 nas células estaminais embrionárias através de BAC recombineering. Assim, o trabalho desenvolvido foi dividido em duas partes de considerável importância para este projecto. Na primeira parte procurou-se contribuir para a geração da linha celular transgénica de células estaminais embrionárias de ratinho, nomeadamente através da instituição de um protocolo de extracção do BAC, assim como um para a sua visualização. Este objectivo foi alcançado através do estudo dos vários passos de extracção de DNA utilizando um kit comercial e um método de extracção ?tradicional?, protocolos que foram posteriormente comparados. Esta parte do estudo revelou vários pontos fracos na utilização do kit commercial e levou à instituição de um protocolo de extracção baseado num outro descrito por Bill Richardson e Nicoletta Kessaris, em 2006. Na segunda parte do trabalho, o intuito era o de contribuir para a validação do modelo utilizado no laboratório, mais especificamente atendendo à relação entre a expressão do gene Dll1, o ?movimento nuclear inter-cinético? e o ciclo celular nas rosetas. Para isso, realizaram-se ensaios imunocitoquímicos em células estaminais embrionárias de ratinho contendo um repórter fluorescente para monitorizar a actividade do gene Dll1, amplificadas e diferenciadas in vitro, e concluiu-se que o seu comportamento podia ser considerado análogo ao observado em células do tubo neural (in vivo)., en=The work described here aims to contribute to the understanding of Notch pathway, particularly to enlighten the possible correlation between Notch and the cell cycle during neurogenesis. Specifically, this work aims to generate a transgenic mouse ES cell lines containing a fluorescent reporter for the purpose of visualizing the activity of Dll1 in ES cells using BAC recombineering. Therefore, the work performed was divided in two important parts for this project. The first part of the work aimed to contribute to the generation of the transgenic mouse ES cells line, namely by establishing a reproducible and consistent BAC extraction, as well as a visualization protocol. This objective was achieved by studying the several steps of DNA extraction using a commercial kit and a ?traditional extraction? protocol that were compared a posteriori. This study revealed several weaknesses of the commercial kit and led to the establishment of an extraction protocol based on one described by Bill Richardson and Nicoletta Kessaris, in 2006. In the second part, the aim was to contribute to the validation of the model used in the lab, namely concerning the relation between Dll1 expression, INM and cell cycle in the rosettes. For this, we did immunocytochemistry assays in mouse ES cells with a fluorescent reporter for Dll1 activity, amplified and differentiated in vitro, and concluded that their behavior might be considered analogous to that observed in cells from the neural tube (in vivo).}

Discussão: novembro 23, 2009, 9:0

Publicação

Obra sujeita a Direitos de Autor

Orientação

AUTOR

Rúben Duarte Magalhães Alves Pereira (ist155754)

ORIENTADOR

Domingos Manuel Pinto Henrique

Departamento de Engenharia Química e Biológica (DEQB)

Professor Associado Convidado