{en=Optimizing virus discovery cDNA-AFLP (VIDISCA)} {} EVALUATED

Detalhes: {pt=Virus discovery cDNA-AFLP (VIDISCA) é um método altamente reproduzível que permite a detecção de vírus de ARN/ADN sem o conhecimento prévio da sua sequência. A amplificação de sequências virais é baseada na presença de locais de enzimas de restrição. Assim, em semelhança a outras técnicas de amplificação aleatória, a detecção de vírus com VIDISCA encontra-se restringida a amostras sem interferência celular e com elevada concentração de vírus. O objectivo deste projecto foi aumentar a sensibilidade do método VIDISCA através da eliminação de duas fontes principais que competem na amplificação de PCR: ADN cromossómico e ARN ribossómico (rARN). De modo a eliminar o ADN celular residual, investigou-se por PCR em tempo-real o efeito de diferentes velocidades de centrifugação e comparou-se a acção de duas DNases. Por outro lado, através do uso de primers que anilam especificamente a sequências virais e não a rARN na reacção de retrotranscrição, obteve-se um aumento de 100 vezes na sensibilidade do método VIDISCA. Por fim, foi testado um novo sistema para purificar vírus em sistemas contendo células. Após ajuste de parâmetros, através do uso de imunoglobulinas intravenosas (IVIG) acopladas ao complexo proteína A-sefarose, obteve-se uma separação física tal que a detecção de vírus foi possível com uma sensibilidade comparável à de sistemas livres de células. , en=Virus discovery cDNA-AFLP (VIDISCA) is a highly reproducible method that allows the detection of RNA/DNA viruses in a sequence-independent fashion. Amplification of viral sequences with VIDISCA is based on the recognition of restriction enzyme sites. Thus, similarly to other random techniques, viral detection with VIDISCA is restricted to samples without cellular background and with high viral loads. We aimed at obtaining a higher sensitivity of VIDISCA by the elimination of two major interfering sources that compete in the PCR amplifications: chromosomal DNA and ribosomal RNA (rRNA). In order to achieve sufficient depletion of the residual chromosomal DNA, we investigated by real-time PCR the effect of different centrifugation speeds and compared the action of two different DNases. In addition, by using primers in a reverse-transcription (RT) reaction that specifically anneal to viral sequences and not to rRNA, we obtained an increase of 100 fold in the sensitivity of VIDISCA. Moreover, a new approach for viral purification in systems with high amounts of cells was tested and its parameters adjusted. By using a complex composed by intravenous immunoglobulins (IVIG) coupled to protein A-sepharose beads, we obtained a physical separation of viruses that allowed viral detection with a comparable sensitivity to cell-free systems. }

Discussão: fevereiro 6, 2009, 14:0

Orientação

AUTOR

Nuno Miguel Rodrigues Pascoal Faria (ist151362)

CO-ORIENTADOR

Domingos Henriques

Instituto de Medicina Molecular , F. Medicina Lx, Unidade de Biologia do Desenvolvimento

Professor Auxiliar

ORIENTADOR

Gabriel António Amaro Monteiro

Departamento de Engenharia Química e Biológica (DEQB)

Professor Auxiliar