Dissertação

{en_GB=Genome editing of Mesenchymal Stem/Stromal Cells (MSCs) by CRISPR/Cas9 technology for azurin-based anticancer therapies} {} EVALUATED

{pt=As terapias sistémicas convencionais aplicadas em oncologia causam diversos efeitos secundários. Por isso são necessárias terapias localizadas mais específicas de forma a permitir um tratamento mais seguro e preciso. As Células Estaminais do Mesênquima (CEMs) apresentam características que lhes permitem serem veículos de entrega de fármacos dirigidos aos locais tumorais, devido ao seu potencial imunomodulatório e de migração em direção aos tumores. A azurina é uma proteína bacteriana produzida por Pseudomonas aeruginosa que tem sido explorada como agente antitumoral. A estratégia deste trabalho visa a edição genética das CEMs a fim destas transportarem a azurina para o microambiente tumoral. Os passos iniciais desta estratégia foram realizados neste trabalho, nomeadamente o desenho e o teste de quatro gRNAs, para produzirem cortes na cadeia dupla de DNA num local genómico seguro, o primeiro intrão do gene PPP1R12C, e o desenho de um template dador para a incorporação de uma sequência codificante da azurina através do mecanismo CRISPR/Cas9, por homologia. O desenho das guides foi feito com recurso a ferramentas bioinformáticas, considerando o menor número e a localização de off-targets em regiões exónicas e os scores mais elevados. A taxa de eficiência de clivagem foi avaliada em células HEK293T recorrendo a kits comerciais. Das guides testadas, em duas verificou-se corte com eficiências de 2.72 e 3.00. Relativamente à construção do template dador, foram amplificadas todas as partes, sendo que os próximos passos são as ligações entre elas para originar o template que permita fazer a reparação dos cortes em futuras experiências em CEMs., en=The conventional systemic therapies applied in cancer treatments cause several side effects in patients. Therefore, more specific targeted therapies are in need to a more safe and precise treatment. MSCs present the ability to be vehicles for drug delivery to the tumour sites due to their unique immunomodulation and migration potential towards tumours. Azurin is a bacterial protein produced by Pseudomonas aeruginosa that has been strongly explored considering its antitumoral activity. Thus, the strategy of the present work includes the genetic edition of MSCs to establish these as potential carriers of azurin into tumoral sites. The initial steps of this strategy were performed in this work, namely the design and test of four gRNAs to produce DSBs in a genomic safe harbour, the first intron of PPP1R12C gene, and the design of a donor template that will allow the incorporation of the azurin encoding sequence into this locus via CRISPR/Cas9 mechanism through homology repair. The guides were designed using bioinformatics tools and chosen considering the lower number and site of off-targets in exonic regions and the higher score between all. The efficiency in HEK293T cells was assessed with the GeneArt™ Genomic Cleavage Detection Kit (Invitrogen™). Of the guides tested, two were successful in producing the desired cuts with efficiencies of 2.72 and 3.00. Concerning to the construction of donor template, all parts were obtained, being that the next steps are the ligations between them to produce a donor template capable of repairing the DSB in future experiments using MSCs.}
{pt=Células Estaminais do Mesênquima, Azurina, Terapias anticancerígenas, Edição do genoma, Mecanismo CRISPR/Cas9, Reparação por Homologia direta, en=Mesenchymal Stem/Stromal Cells, Azurin, Anticancer therapies, Genome editing, CRISPR/Cas9 mechanism, Homology direct-Repair}

Novembro 29, 2017, 14:0

Publicação

Obra sujeita a Direitos de Autor

Orientação

ORIENTADOR

Evguenia Bekman

Instituto de Medicina Molecular-Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa

Investigadora Auxiliar Convidada

ORIENTADOR

Nuno Filipe Santos Bernardes

Instituto de Bioengenharia e Biociências, Instituto Superior Técnico

Doutor