Dissertação

{en_GB=Comprehensive Study of the Stability of Genomic Imprinting During Mouse iPSC Reprogrammind} {} EVALUATED

{pt=As células estaminais pluripotentes induzidas (iPSCs) estão sujeitas a erros provenientes das alterações epigenéticas significantes aquando da sua reprogramação. O imprinting parental, um fenómeno epigenético que resulta na expressão monoalélica definida pela metilação diferencial dos dois alelos parentais, encontra-se frequentemente afectado em iPSCs. Esta alteração compromete a pluripotência destas células. No entanto, até hoje, nenhum estudo avaliou sistematicamente a manutenção do imprinting parental durante o processo de reprogramação. Neste projecto, usamos um sistema de reprogramação que nos permite avaliar a evolução da metilação dos dois alelos parentais, baseado na presença de polimorfismos ao nível do DNA. Três loci de diagnóstico foram avaliados durante a reprogramação, na presença e na ausência de Ácido Ascórbico (AA), implicado na protecção do imprinting. No locus Peg3 não foram detectadas alterações no imprint na presença de AA. Já no caso do Igf2-H19, a instabilidade inicial não afectou o estabelecimento correcto do imprinting no final da reprogramação. No caso da região Dlk1-Dio3, só os estadios intermédios puderam ser avaliados e revelaram erros de imprinting causados por hipermetilação, em linha com resultados anteriormente publicados. Estes resultados preliminares indicam que erros de imprinting ocorrem durante a reprogramação, com variações de locus para locus. Futuros estudos serão necessários para avaliar o imprinting parental e entender o panorama geral destes erros durante a reprogramação. Tal informação é fulcral para o desenvolvimento de novos protocolos que tenham como objectivo salvaguardar a preservação dos imprints, de forma a melhorar a qualidade e segurança das iPSCs nas suas mais diversas aplicações. , en=Reprogramming of the differentiated state into an Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) involves major epigenetic rewiring, which is highly susceptible to errors. Genomic Imprinting, an epigenetic phenomenon that renders genes monoallelically expressed, is frequently disrupted in iPSCs. Moreover, disruption of imprinting compromises pluripotency of iPSCs. However, up to now, no systematic monitoring of imprinting has been performed during reprogramming. In this project, we used a reprogramming system whereby the donor cell contained both an integrated inducible reprogramming cassette and DNA polymorphisms to distinguish both parental alleles to assess imprinting maintenance of the Peg3, Igf2-H19 and Dlk1-Dio3 diagnostic imprinted loci during reprogramming (with or without ascorbic acid – AA) by allele-specific methylation analysis. For the Peg3 locus, imprinted defects were not found in the presence of AA. For Igf2-H19 locus, a non-allelic methylation assay showed that, at most, imprinting is labile early during reprogramming, but resolves on itself resulting in miPSCs with normal imprinting. For Dlk1-Dio3, evaluation of imprinting status could only be evaluated for early stages of reprogramming, where errors were found as previously reported. Our preliminary results points out that imprinted defects do occur, varies from locus to locus and might occur from early stages of reprogramming. Genome-wide assessment of imprinting status will be required to fully understand the extent to which imprinting defects occur. We believe this knowledge is valuable for future development of new reprogramming protocols aiming at preventing imprinting disruption and guarantee the safety of use of iPSCs in their various applications. }
{pt=iPSCs, Imprinting Genómico, Reprogramaçãode Células, Peg3, Igf2-H19, Dlk1-Dio3, en=iPSCs, Genomic imprinting, Cell Reprogramming, Peg3, Igf2-H19, Dlk1-Dio3}

Novembro 22, 2016, 11:0

Publicação

Obra sujeita a Direitos de Autor

Orientação

ORIENTADOR

Simão José Teixeira da Rocha

Instituto de Medicina Molecular – Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa

Doutor

ORIENTADOR

Tiago Paulo Gonçalves Fernandes

Departamento de Bioengenharia (DBE)

Colaborador Não Remunerado Docente