Dissertação

{en_GB=Bio-engineering of neuromesodermal progenitors} {} EVALUATED

{pt=Os progenitores de neuromesoderme (NMPs) são uma população celular apontada como responsável pela origem quer de precursores do sistema nervoso central posterior, quer de linhagens da mesoderme que irão gerar a medula espinal. Esta população está activa durante a gastrulação embrionária, em que células do epiblasto sofrem diferenciação para estabelecerem três linhas germinais que darão origem a todos os tecidos do embrião. A partir de estudos in vitro, NMPs podem ser gerados a três dimensões (3D), em agregados celulares chamados gastrulóides, usando a via de sinalização Wnt para activar elongação tridimensional. No entanto, este é um método com limitações em termos de eficiência e reprodutibilidade. Por essa razão, neste projecto tive por objectivo desenvolver métodos mais robustos para gerar e propagar NMPs em cultura a partir de células estaminais embrionárias de murganho (mESCs). Para medir os resultados, utilizei uma avaliação morfológica, em que os agregados foram contados e medidos em dias-chave, fazendo também detecção por fluorescência de células-repórter para o gene Sox1 e imunofluorescência com marcadores moleculares relevantes para identificar NMPs. Os resultados mostram um aumento no número de agregados formados e elongados quando o polímero (PLGA) é usado, exibindo também um desenvolvimento mais padronizado, com menos variabilidade e portanto mais reprodutível do que o protocolo-base. Finalmente, encontrei tecido neural emergente nos agregados em extensão quando há presença das fibras, organizado numa estrutura semelhante ao tubo neural e mostrando indícios de polaridade epitelial apico-basal, sugerindo portanto o uso de PLGA enquanto suporte mecânico na organização dos tecidos., en=Neuromesodermal progenitors (NMPs) are a cell population that has been pointed as responsible for generating both posterior neural precursors and mesoderm derivatives that will develop into the spinal cord. These progenitors function during embryonic gastrulation when epiblast cells undergo differentiation to establish three germ layers (endoderm, mesoderm, and ectoderm) that will give rise to all tissues in the embryo. NMPs have been studied in vitro, using a protocol for three-dimensional (3D) generation of cell aggregates, entitled gastruloids, through self-organization in presence of Wnt pathway agonists that activate polarized 3D elongation. However, this method has limitations, concerning efficiency and reproducibility of the process. In this work, I aimed at developing more robust methods to generate and propagate NMPs in culture, starting from mouse embryonic stem cells (mESCs). To achieve this aim, I employed a mechanical scaffold during in vitro gastruloid development, using poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) fibers. To monitor the process, I used morphological approaches in which aggregates were counted and measured, while also doing fluorescence detection with Sox1::GFP cells and immunofluorescence with relevant molecular markers for NMPs. Results show an increase in successful gastruloid formation and elongation when PLGA was used, while also exhibiting a patterned cell growth with less variability, thus representing a more robust protocol than the original one where fibers were not used. Additionally, I found that neural tissue emerging in extending fiber-supported gastruloids is organized in a neural tube-like structure, showing hints of apicobasal epithelial polarity and suggesting that fibers provide adequate mechanical support for tissue organization.}
{pt=mESCs; NMPs; PLGA; Gastrulóides., en=mESCs; NMPs; PLGA; Gastruloid.}

Novembro 11, 2016, 10:30

Publicação

Obra sujeita a Direitos de Autor

Orientação

ORIENTADOR

Maria Margarida Fonseca Rodrigues Diogo

Departamento de Bioengenharia (DBE)

Professor Auxiliar

ORIENTADOR

Domingos Manuel Pinto Henrique

Instituto de Medicina Molecular – Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa

Doutor