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Dissertação

{en_GB=Characterization and specific isolation strategies of prostate cancer exosomes: Preliminary work for the establishment of an integrated microfluidic platform for exosome isolation and analysis} {} EVALUATED

Detalhes: {pt=Os exossomas são vesículas lipídicas secretadas por células que representam o seu tecido de origem, ao expressar marcadores de superfície e por terem conteúdo proteico e de ácidos nucleicos semelhantes à célula-mãe. Devido a esta correlação, à alta disponibilidade e acessibilidade em fluidos corporais, os exossomas são uma grande promessa no ramo de Diagnósticos. Analisá-los é no entanto complexo devido ao tamanho e resolução dos métodos usualmente usados, que por sua vez são pouco automatizados e demorados. Antes do desenvolvimento do dispositivo de microfluídica no Instituto Fraunhofer de Leipzig, para diagnóstico do cancro da próstata, os exossomas de linhas celulares deste cancro, LNCaP e PC-3, são caracterizados. A expressão proteica foi avaliada por anticorpos secundários fluorescentes anti-PSMA (sigla em inglês, Antigénio de Membrana Específico da Próstata) e por exossomas fluorescentes para experiências de captura específica. Estas experiências foram efectuadas num aparelho tipo FACS, o iQUE screener, medindo exossomas conjugados com contas de látex, e exossomas livres em lâminas de vidro activadas com grupos carboxilo ou em tiras de teste por fluxo lateral. A morfologia das vesículas foi confirmada por SEM (sigla em inglês, microscopia electrónica por varrimento). O método do iQUE foi optimizado em termos de duração de centrifugação, tubos, concentração das contas de látex e soluções de bloqueio para os anticorpos. Já os protocolos de captura específica requerem mais optimizações, especialmente com soluções de bloqueio válidas para vesículas. , en=Exosomes are nanosized cell-secreted lipid vesicles that represent their tissue of origin by displaying surface markers and by carrying protein and nucleic acid cargo similar to their origin cell. Due to this correlation, high availability and accessibility in bodily fluids, exosomes show great promise in Diagnostics. Exosome analysis is however complicated due to their size and limited resolution of the commonly used analysis methods, which are also highly manual and time consuming. For future development of a microfluidic device for prostate cancer (PCa) diagnosis at the Fraunhofer IZI, Leipzig, exosomes from PCa cell lines, LNCaP and PC-3, must be characterized. Protein expression was assessed by fluorescently labeled secondary antibodies anti-PSMA (Prostate Specific Membrane Antigen) and self-fluorescent exosomes for specific capture experiments. These were carried out by measuring bead-bound exosomes on a FACS-like device, the iQUE screener, and free exosomes on carboxyl-activated glass slides and lateral flow nitrocellulose strips. Morphology of vesicles was confirmed by SEM imaging. The iQUE method was optimized in terms of centrifugation duration, tubes, bead concentration and blocking solution for antibodies. It was possible to confirm the expression of PSMA in the cells lines but such expression was inconclusive for exosomes. Specific capture protocols require further adjustments, namely in blocking. Once these are made, future experiments will include biological samples as blood and urine and testing of proprietary matrixes for specific capture. The future liquid biopsy modular platform will enable pre-symptomatic screening and early detection of cancer, using low amounts of samples and reagents.}
Keywords: {pt=cancro da próstata, exossomas, isolamento, microfluídica, PSMA, vesículas extracelulares, en=diagnostics, exosomes, isolation, microfluidics, prostate, PSMA}

Discussão: novembro 21, 2016, 9:30