Dissertação
{en_GB=Advancing manufacturing of mesenchymal stem/stromal cell-derived extracellular vesicles towards the treatment of myocardial infarction} {} EVALUATED
{pt=As doenças cardiovasculares, incluindo o enfarte do miocárdio, permanecem a principal causa mundial de mortalidade e morbilidade, devido a ineficácia das atuais terapêuticas sobre os mecanismos fundamentais da regeneração cardíaca. Neste contexto, vesículas extracelulares (EVs) derivadas de células estaminais mesenquimais/do estroma humanas (hMSCs) surgem como alternativas promissoras. No entanto, a sua translação clínica e limitada pela falta de métodos de produção e isolamento robustos e escalonáveis. Neste trabalho, propomos o uso de uma plataforma baseada em bioreactores para maximizar o rendimento e a qualidade de EVs geradas por hMSCs de tecido adiposo (hAT-MSCs), enquanto implementámos um protocolo de concentração e isolamento de EVs escalonável, com potencial de integração num bioprocesso contínuo. Para tal, usamos um sistema de cultura em bioreactores de tanque agitado baseado em microcarriers para expansão de hAT-MSCs e produção de EVs sob condições de hipóxia, enquanto avaliávamos a influência de diferentes estratégias de alimentação. As EVs foram isoladas por filtração de fluxo tangencial e cromatografia por exclusão de tamanho. O potencial da estratégia aplicada e evidenciado por comparação com culturas em sistemas estáticos e isolamento de EVs por protocolos baseados em ultracentrifugação. Elevados rendimentos de EVs foram associados a produção em bioreactores com maior frequência de mudança de meio (8.4x10ˆ9 partícula/10ˆ6 célula; 1.4x10ˆ9 partícula/mL de meio condicionado). De salientar, as EVs produzidas em bioreactores promoveram a migração celular e manifestaram capacidade aumentada na estimulação da angiogénese, em ensaios in vitro, em comparação com EVs geradas em culturas estáticas, realçando o seu promissor potencial terapêutico para regeneração cardíaca. , en=Cardiovascular diseases, which include myocardial infarction, remain a leading cause of morbidity and mortality worldwide, with current therapies failing to address fundamental mechanisms of cardiac regeneration. In this context, extracellular vesicles (EVs) derived from human mesenchymal stem/stromal cells (hMSCs) are arising as promising therapeutic alternatives. However, their clinical translation is currently limited by the lack of robust and scalable manufacturing processes. In this work, we propose the use of a bioreactor-based platform to maximize the yields and quality of generated EVs, while implementing scalable downstream processing protocols that could be integrated in a continuous bioprocess. To establish this, we used a microcarrier-based culture system in stirred tank bioreactors for human adipose tissue-derived MSC (hAT-MSC) expansion and EV production under hypoxic conditions, while evaluating the influence of different feeding strategies. The hAT-MSC-derived EVs were isolated by tangential flow filtration followed by size exclusion chromatography. The potential of the applied strategy is highlighted by comparison with cell culture in static systems and EV isolation by the gold standard, although less scalable, ultracentrifugation-based protocols. Higher EV yields were linked to EV production in bioreactors with increased culture medium exchange frequency during the cell culture period (8.4x10ˆ9 particle/10ˆ6 cell; 1.4x10ˆ9 particle/mL of conditioned culture medium). Importantly, EVs produced in bioreactors promoted cell migration and manifested increased ability to stimulate angiogenesis, in in vitro assays, in comparison to EVs generated in static cultures, highlighting their promising therapeutic potential in cardiac regeneration settings.}
novembro 22, 2021, 11:0
Orientação
ORIENTADOR
Maria Margarida Fonseca Rodrigues Diogo
Departamento de Bioengenharia (DBE)
Professor Auxiliar
ORIENTADOR
Maria Margarida de Carvalho Negrão Serra
iBET – Instituto de Biologia Experimental e Tecnológica
Doutora