Dissertação

{en_GB=Unveiling the CCBE1 role on human iPSC-derived Cardiac Fibroblasts differentiation and functionality} {} CONFIRMED

{pt=As doenças cardiovasculares são a principal causa de morte em todo o mundo. Em particular, no enfarte do miocárdio (EM), o músculo cardíaco funcional lesado é posteriormente substituído por um tecido fibrótico composto por fibroblastos cardíacos (CF) ativados. Diversas terapias alternativas têm sido atualmente desenvolvidas, utilizando o secretoma das células para ajudar a regenerar o miocárdio, tornando, portanto, importante identificar as moléculas-chave que atuam no microambiente cardíaco. Neste contexto, a CCBE1 (collagen and calcium-EGF binding domain 1) foi detetada em percursores cardíacos durante o desenvolvimento embrionário em ratinhos. Assim sendo, o principal objetivo desta tese foi investigar o papel desta proteína ao longo da diferenciação em CF, usando uma linha hiPSC modificada através da tecnologia de interferência CRISPR (CRISPRi) para reduzir a expressão do gene CCBE1. Quer a linha celular hiPSC-WTC como as linhas celulares modificadas com o sistema CRISPRi foram diferenciadas em CF, tendo exibido claras alterações morfológicas e fenotípicas ao longo do processo. A adição diária de doxiciclina durante a diferenciação impactou o crescimento das células, mas não na sua morfologia, viabilidade e fenótipo. Ao utilizar-se um meio específico de fibroblastos suplementado com inibidor de TGF-β gerou-se um maior número de fibroblastos inativos. Os CF diferenciados conseguiram manter o seu fenótipo durante 50 dias em cultura e mostrar características típicas de fibroblastos, como poderem ser ativados e conseguirem migrar. Ao revelar o papel principal do CCBE1 na diferenciação e ativação dos CF (simulando o EM), esperamos conceder novas ideias para o desenvolvimento de terapias regenerativas direcionadas à CCBE1., en=Cardiovascular diseases are the leading cause of mortality worldwide. This group of disorders, including myocardial infraction (MI), arises from the widely and irreversible loss of functional cardiac muscle, which is replaced by a fibrotic tissue mainly composed by activated cardiac fibroblasts (CF). Alternative therapies have been focusing on the direct cardiac muscle tissue regeneration through cell-free approaches, thus making crucial to identify key molecules acting on the cardiac microenvironment. In this context, CCBE1 (collagen and calcium-EGF binding domain 1) was identified being expressed in the epicardium during mouse embryonic development. However, its functional role during CF specification and functionality is still unknown. Therefore, the main aim of this thesis was to unveil CCBE1 role in CF specification, by using a modified hiPSC line displaying the CRISPR interference technology (CRISPRi) to selectively knockdown (KD) CCBE1 gene expression. Both wild-type and modified CRISPRi cell lines were differentiated into CF, showing clear morphological and phenotypical changes throughout the differentiation process. Daily doxycycline addition from iPSC to CF was identified to affect the cells’ growth, but not their morphology, viability and phenotype. Using a fibroblast-specific medium combined with a TGF-β inhibitor impacted allowed to generate a higher number of quiescent fibroblasts. The derived CF were able to maintain their phenotype for up to 50 days in culture, to be activated into myofibroblasts and to migrate towards a wound. By unveiling the CCBE1 key role on CF differentiation and activation (mimicking MI) we expect to provide new insights towards the development of CCBE1-targeted regenerative therapies.}
{pt=CVD, Fibrose Cardíaca, Fibroblastos Cardíacos, hiPSC, CCBE1, CRISPRi, en=CVD, Cardiac Fibrosis, Cardiac Fibroblasts, hiPSC, CCBE1, CRISPRi}

Novembro 22, 2019, 16:30

Orientação

ORIENTADOR

Maria Margarida Fonseca Rodrigues Diogo

Departamento de Bioengenharia (DBE)

Professor Auxiliar

ORIENTADOR

Maria Margarida de Carvalho Negrão Serra

iBET/ITQB-NOVA

Investigador Auxiliar