Dissertação

{en_GB=Improving the differentiation of hiPSC into cardiomyocytes as 3D aggregates through modulation of mechanical and chemical factors } {} EVALUATED

{pt=As doenças cardiovasculares (CVD) representam uma das principais causas de mortalidade, associado à perda excessiva de cardiomiócitos (CM). A utilização de células estaminais pluripotentes humanas para diferenciar CM (hiPSC-CM) representa uma nova alternativa terapêutica para o tratamento destas doenças. No entanto, a aplicação desta tecnologia requer uma extensa produção das mesmas. Neste trabalho é reportada a implementação de um protocolo de diferenciação em 3D para gerar hiPSC-CM em bioreactores de tanque agitado (STB). O protocolo de diferenciação em 2D previamente publicado pelo nosso grupo foi transferido para STB, utilizando agregados gerados em cultura estática. Os agregados de hiPSC-CM obtidos no final do protocolo de diferenciação demonstravam contracção espontânea (desde dia 8), expressão de genes específicos para CM (TNNT2, MYH6 e MYH7) e 63 % de células Sirpα/β positivas, sendo o rendimento final da diferenciação 0.09. Adicionalmente, a análise a metabolitos extracelulares demonstrou uma alteração entre um perfil de metabolismo glicolítico e oxidativo, no início do batimento espontâneo. Para otimizar o processo de diferenciação o impacto do método de agregação, meio de cultura de hiPSCs e a concentração de CHIR99021 no meio de diferenciação foram analisados com base na pureza e rendimento final da diferenciação em CM. A combinação de condições que aumentou ambos os parâmetros foi a agregação dinâmica, em meio de cultura mTeSR™1 e utilizando 12 µM de CHIR99021 para a diferenciação da linha hiPSC-3. A análise de todas as condições demonstrou que a eficiência da diferenciação em CM e dependente da linha celular. , en=Cardiovascular diseases (CVD) remain a major cause of morbidity and mortality worldwide leading to a massive and irreversible loss of cardiomyocytes (CM). Differentiating CM from human pluripotent stem cells (hiPSC-CM) offers an exciting new treatment option for such diseases. However, to enable the application of this technology, an extensive supply of hiPSC-CM is required. Herein, a 3D differentiation protocol for generation of hiPSC-CM as 3D aggregates was implemented in stirred tank bioreactors (STB). The 2D monolayer protocol for cardiac differentiation of hiPSC established by our group was transferred to a 3D culture format using STB, yielding 0.09 of CM differentiation efficiency and 63 % of cells expressing Sirpα/β. Beating hiPSC-CM aggregates were observed by day 8 and from day 6 of the culture cells expressed CM-specific genes (TNNT2, MYH6 and MYH7). A metabolic analysis indicated a shift from glycolysis to a more oxidative metabolism, by the time spontaneous beating started. In addition, 24 % of αSMA positive cells were found on hiPSC-CM aggregates by day 15 indicating the presence of other cell types on the aggregates. Aiming at optimizing the differentiation process, the impact of critical process parameters including aggregation method, culture medium and CHIR99021 concentration on CM differentiation yields and purity was evaluated in three different hiPSC lines. The best performing condition was aggregation in dynamic culture, using mTeSR™1 medium and 12 µM of CHIR99021, in hiPSC-3. Although, CM differentiation was achieved in all tested conditions, the results suggest that it is hiPSC line dependent. }
{pt=Terapias celulares, hiPSC, Diferenciação cardíaca, Sistemas de cultura 3D, Optimização de bioprocessos, Agregados de hiPSC-CM., en=Cell therapies, hiPSC, Cardiomyocyte differentiation, 3D culture systems, Bioprocess optimization, hiPSC-CM aggregates.}

Novembro 14, 2019, 10:0

Orientação

ORIENTADOR

Maria Margarida Fonseca Rodrigues Diogo

Departamento de Bioengenharia (DBE)

Professor Auxiliar

ORIENTADOR

Maria Margarida de Carvalho Negrão Serra

iBET/ITQB-NOVA

Investigador Auxiliar