Dissertação
Combining CRISPR-Cas with RecET towards efficient genetic manipulations on Bacteria: New strategies for direct in vivo cloning, gene deletion and genome engineering on Bacteria EVALUATED
Na última década, a tecnologia de CRISPR-Cas9 mudou e melhorou radicalmente a maneira como as manipulações genéticas são levadas a cabo. No entanto, o impacto que esta tecnologia teve na manipulação de genomas bacterianos foi bastante baixo. Tal facto deve-se sobretudo à fraca capacidade das bactérias sobreviverem às quebras na dupla-helice criadas pela proteína Cas9. O objetivo desta tese é desenvolver ferramentas de manipulação genética em bactérias, utilizando em conjunto o CRISPR-Cas9 e o sistema do profago Rac de Escherichia coli, RecET. Hipotetizámos que a habilidade do sistema RecET de levar a cabo recombinação entre duas moléculas de DNA linear permitiria às bactérias sobreviver ao corte criado pela Cas9. Desenvolvemos três diferentes técnicas, uma técnica de clonagem in vivo utilizando RecET, e duas técnicas utilizando CRISPR-Cas9 e RecET em conjunto, uma de eliminação génica e outra de edição de genomas. Concluímos que o sistema RecET apresenta um grande potencial para manipulações genéticas. A atividade conjunta de RecET e CRISPR-Cas9 aumenta a taxa de sobrevivência aos cortes criados por Cas9, e permite a criação de eliminações mais curtas, surgindo assim como uma nova técnica de eliminação génica. No entanto, a ação conjunta dos dois sistemas não permitiu a criação de uma técnica de edição de genomas, e mais experiências terão de ser desenhadas para obter mais informação.
novembro 28, 2016, 15:0
Publicação
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Orientação
ORIENTADOR
Isabel Maria De Sá Correia Leite de Almeida
Departamento de Bioengenharia (DBE)
Professor Catedrático