Dissertação
Analytical characterization of protein-based biopharmaceuticals EVALUATED
Os biofarmacêuticos são produzidos através de processos biotecnológicos, recorrendo a métodos de biologia molecular. Abrangem diversas classes, tais como ácidos nucleicos e proteínas. O objetivo deste projeto foi desenvolver, entender e implementar metodologias analíticas adequadas para a caracterização de macromoléculas biológicas, nomeadamente proteínas. Este projeto engloba a caracterização de proteínas modelo (Albumina de Soro Bovino, Ovalbumina e Lisozima) e um anticorpo monoclonal, ARD_2019, através do desenvolvimento de técnicas analíticas, como titulação de Karl Fischer (KFT), Cromatografia de Exclusão de Molecular (SEC), Electroforese em Gel de Poliacrilamida (SDS-PAGE) e Cromatografia de Troca Iónica (IEX). A partir do método de KFT, determinou-se o conteúdo de água do processo de BSA [6.87% (w/w)] e do ARD_2019 [0.55 - 3.02% (w/w)]. O método de SEC, otimizado primeiramente para proteínas modelo com pesos moleculares conhecidos e aplicado ao anticorpo ARD_2019, permitiu calcular o seu peso molecular nativo, bem como de espécies de alto e baixo peso molecular. A técnica SDS-PAGE foi também desenvolvida. Os resultados obtidos para o anticorpo isolado, estão de acordo com os resultados obtidos pela técnica de SEC. A avaliação da pureza do anticorpo, foi realizada por SDSPAGE, concluindo-se que o anticorpo se encontrava puro, observando-se a separação das cadeias pesada (50 kDa) e leve (25 kDa) do anticorpo. A determinação da heterogeneidade de carga por IEX foi realizada em gradiente de pH e de força iónica. Para o anticorpo monoclonal, ARD_2019, foi possível determinar a presença de 8 variantes de carga diferentes.
novembro 15, 2019, 9:30
Publicação
Obra sujeita a Direitos de Autor
Orientação
ORIENTADOR
Ana Margarida Nunes da Mata Pires de Azevedo
Departamento de Bioengenharia (DBE)
Professor Auxiliar
