Dissertação

Generating isogenic NPC1 hiPSC lines for disease modelling using the CRISPR/Cas9 system EVALUATED

CRISPR/Cas9 é uma ferramenta poderosa e versátil para edição genética. Neste trabalho, esta ferramenta foi aplicada para gerar linhas de NPC1 isogénicas para modelar a doença de Niemann-Pick tipo C (NPC) a partir de células humanas pluripotentes induzidas (hiPSCs). O objetivo era introduzir uma mutação específica chamada de substituição I1061T, que ocorre no exão 21 do gene NPC1. Para tal, as hiPSCs foram transfetadas com um plasmídeo Cas9-GFP, um vetor de expressão do RNA guia e um oligonucleótido para servir como molde para reparação por recombinação homóloga (HDR). O molde inclui a substituição I1061T e duas mutações de bloqueio localizadas no motivo adjacente ao protoespaçador (PAM), que é necessário para o reconhecimento pelo sistema CRISPR/Cas9. As mutações de bloqueio integram a nossa estratégia para aumentar o número de hiPSCs corretamente editados ao reduzir reedições pela Cas9. Dos 62 clones que foram expandidos com sucesso, apenas 3 tinham mutações no locus de interesse segundo a análise feita por sequenciação pelo método de Sanger. Adicionalmente, nenhum destes 3 clones incorporou o molde de HDR, apresentando antes mutações aleatórias resultantes de reparação por união de extremidades não-homólogas (NHEJ). De especial interesse é um clone com uma mutação que causa um final prematuro da expressão proteica e que poderá ser útil como um nocaute de NPC1. No geral, os resultados obtidos não foram ideais, mas estamos confiantes que o trabalho realizado contribuiu para o avanço de futuros desenvolvimentos na modelação da doença de NPC em humanos.
CRISPR/Cas9, edição genética, reparação por recombinação homóloga, células humanas pluripotentes induzidas, NPC1, modelação de doenças

Novembro 22, 2018, 15:0

Publicação

Obra sujeita a Direitos de Autor

Orientação

ORIENTADOR

Tiago Paulo Gonçalves Fernandes

Departamento de Bioengenharia (DBE)

Professor Auxiliar

ORIENTADOR

Evguenia Pavlovna Bekman

SCERG (iBB) e MCFonseca Lab (iMM)

Doutora