Dissertação

Genome editing of Mesenchymal Stem/Stromal Cells (MSCs) by CRISPR/Cas9 technology for azurin-based anticancer therapies EVALUATED

As terapias sistémicas convencionais aplicadas em oncologia causam diversos efeitos secundários. Por isso são necessárias terapias localizadas mais específicas de forma a permitir um tratamento mais seguro e preciso. As Células Estaminais do Mesênquima (CEMs) apresentam características que lhes permitem serem veículos de entrega de fármacos dirigidos aos locais tumorais, devido ao seu potencial imunomodulatório e de migração em direção aos tumores. A azurina é uma proteína bacteriana produzida por Pseudomonas aeruginosa que tem sido explorada como agente antitumoral. A estratégia deste trabalho visa a edição genética das CEMs a fim destas transportarem a azurina para o microambiente tumoral. Os passos iniciais desta estratégia foram realizados neste trabalho, nomeadamente o desenho e o teste de quatro gRNAs, para produzirem cortes na cadeia dupla de DNA num local genómico seguro, o primeiro intrão do gene PPP1R12C, e o desenho de um template dador para a incorporação de uma sequência codificante da azurina através do mecanismo CRISPR/Cas9, por homologia. O desenho das guides foi feito com recurso a ferramentas bioinformáticas, considerando o menor número e a localização de off-targets em regiões exónicas e os scores mais elevados. A taxa de eficiência de clivagem foi avaliada em células HEK293T recorrendo a kits comerciais. Das guides testadas, em duas verificou-se corte com eficiências de 2.72 e 3.00. Relativamente à construção do template dador, foram amplificadas todas as partes, sendo que os próximos passos são as ligações entre elas para originar o template que permita fazer a reparação dos cortes em futuras experiências em CEMs.
Células Estaminais do Mesênquima, Azurina, Terapias anticancerígenas, Edição do genoma, Mecanismo CRISPR/Cas9, Reparação por Homologia direta

Novembro 29, 2017, 14:0

Publicação

Obra sujeita a Direitos de Autor

Orientação

ORIENTADOR

Evguenia Bekman

Instituto de Medicina Molecular-Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa

Investigadora Auxiliar Convidada

ORIENTADOR

Nuno Filipe Santos Bernardes

Instituto de Bioengenharia e Biociências, Instituto Superior Técnico

Doutor