Dissertação
Purification of PaaK and PaaY from Escherichia coli: Study of the possible points of acetylation of these proteins involved in the metabolism of phenylacetic acid degradation EVALUATED
Com vista a melhorar os bioprocessos já utilizados é necessário uma melhor compreensão do metabolismo e da sua regulação. Escherichia coli tem uma importância crucial na biotecnologia. Uma característica deste organismo é a sua capacidade para catabolizar diferentes fontes de carbono. Este estudo focar-se-á numa das vias metabólicas menos conhecida nesta bactéria: o catabolismo do ácido fenilacético. Recentes avanços em técnicas de proteómica revelaram a importância das modificações pós-translacionais em bactérias. Estas aparentam estar envolvidas em mecanismos de regulação até agora desconhecidos ou desvalorizados. Uma das últimas MPT descritas é a acetilação de proteínas e o seu estudo será o alvo central deste trabalho, nomeadamente a acetilação de lisinas. Desenvolveram-se técnicas para sobre-expressar e purificar PaaK e PaaY, duas proteínas críticas no metabolismo deste ácido, usando duas estirpes de E. Coli: BL21 (DE3) e BL21 (DE3) pLysS, e pRSET-C como vetor, obtendo-se assim os genes ligados a uma cauda de histidinas. O processo de purificação realizou-se utilizando cromatografia de afinidade por iões metálicos imobilizados. Concluiu-se que ambas as proteínas são bastante instáveis e sensíveis. Utilizaram-se ainda técnicas de LC-MS/MS, Western blot, eletroforese em gel e ferramentas bioinformáticas e obtiveram-se evidências de que ambas sofrem acetilação química; que PaaY apresenta atividade de acetiltransfe¬rase e que PatZ tem especificidade para algumas lisinas de PaaY. Este trabalho é uma base importante para futuros estudos que possam vir a ser realizados para confirmar as hipóteses apresentadas e para esclarecer a importância da regulação pós-tradução em PaaK e PaaY.
novembro 12, 2015, 10:0
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