Dissertação

Genome Editing via CRISPR/Cas9 Targeted Integration in CHO cells EVALUATED

A inserção de um gene num locus especifico através do sistema CRISPR / Cas9 em células CHO é geralmente conseguida pelo uso de sistemas de reparação de DNA baseados em homologia (HDR). A inserção é limitada pela relativa baixa eficiência de HDR quando comparado com o reparo não dependente de homologia (NHEJ), que é o mecanismo de reparação dominante em mamíferos. A implementação bem-sucedida de um knock-in (KI) baseado em NHEJ em células CHO foi alcançada, originando taxas de integração mais altas comparando com a abordagem baseada em homologia. A seleção de antibióticos foi realizada para melhorar o KI e cinco loci foram testados, permitindo estabelecer um paralelo entre eficiência de integração e a estrutura da cromatina. Determinou-se que genes ativamente transcritos, como COSMC ou Fut8, permitem maiores taxas de integração quando comparadas com as regiões intergénicas. Apesar de seu potencial promissor como um método mais simples e eficiente, a abordagem baseada em NHEJ originou um número médio de 8,8 cópias de BFP por célula, contra apenas 2,6 usando HDR. Para melhorar as taxas de KI por HDR, mas evitando o uso de antibióticos, foi testado um tratamento químico e enriquecimento celular baseado em fluorescência. O enriquecimento com FACS aumentou entre 5 e 12 vezes o número de células que expressam fluorescência através de edição genómica mediada por NHEJ ou HDR, respetivamente. O tratamento químico não melhorou a integração direcionada. Os resultados apresentados são preliminares, exigindo testes adicionais.
Células CHO, CRISPR/Cas9, reparação de ADN, NHEJ, HDR, integração direcionada

Novembro 21, 2017, 9:0

Publicação

Obra sujeita a Direitos de Autor

Orientação

ORIENTADOR

Gabriel António Amaro Monteiro

Departamento de Bioengenharia (DBE)

Professor Associado

ORIENTADOR

Nicole Borth

University of Natural Resources and Life Sciences

Professor Associado