Dissertação

L-asparaginase production by fed-batch fermentation with recombinant Pichia pastoris – Operation modes, condition in bioreactor and kinetic parameters determination EVALUATED

L-asparaginase é uma enzima utilizada no tratamento de Leucemia Linfomablastica Aguda em que as únicas versões comercializadas são de origem bacteriana. Foi produzida em Pichia pastoris uma ASNase de Saccharomyces cerevisiae codificada pelo gene ASP3, sob o controlo do promotor AOX1. P. pastoris, uma levedura metilotrófica, é um sistema reconhecido para a produção heteróloga de proteínas, particularmente biofarmacêuticas e enzimas industriais. Contudo, os efeitos fisiológicos de diferentes estratégias de cultivo resultam em diferentes velocidades específicas de crescimento e diferentes rendimentos. O cultivo descontinuo com alimentação foi divido em quatro fases distintas: inicial de glicerol, adição descontínua de glicerol, fase exaustão/esgotamento e fase de produção. Neste estudo, P. pastoris recombinante foi cultivada a condições ótimas de pH e temperatura usando um meio definido modificado, que para o kLa inicial ótimo produziu-se 31 g.L-1 durante a fase de batelada com glicerol resultando num rendimento de 0.77 g.gglycerol-1 e uma velocidade de crescimento de 0.21 h-1. Com 12 h de alimentação limitada de glicerol alcançou-se 65 g.L-1 de biomassa seca, com baixos níveis de etanol detetados. Com fermentação de alta densidade celular em biorreator produziu-se até 91 g.L-1. Durante a fase de indução com metanol observou-se uma velocidade específica de crescimento até 0.039 h-1. O rendimento em enzima por unidade de massa seca atingiu 37 U.g-1, sem ter sido detetada atividade enzimática no sobrenadante, resultando no rendimento volumétrico de 3315 U.L-1 e uma produtividade volumétrica global de 31 U.L-1.h-1.
L-asparaginase, Pichia pastoris, meio definido, culturas de alta densidade celular, parâmetros cinéticos

Novembro 23, 2016, 9:0

Publicação

Obra sujeita a Direitos de Autor

Orientação

ORIENTADOR

Luís Joaquim Pina da Fonseca

Departamento de Bioengenharia (DBE)

Professor Associado

ORIENTADOR

Adalberto Pessoa Junior

Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo

Professor Titular